VEGF反義寡核苷酸治療皮膚血管瘤的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下四個部分展開論述：
　　第一部分 皮膚血管瘤中VEGF和NOS的表達(dá)及其與血管增生的關(guān)系
　　目的：研究內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在增生期皮膚血管瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性,探討它們在皮膚血管瘤血管生成中的作用。
　　方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測51例增生期皮膚血管瘤標(biāo)本中eNOS、iNOS和 VEGF的表達(dá),第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)血

2、管內(nèi)皮細(xì)胞特異性染色計數(shù)腫瘤微血管密度(MVD)。
　　結(jié)果：42例血管瘤組織表達(dá)VEGF,32例表達(dá)iNOS,37例表達(dá)eNOS,血管畸形表達(dá)較弱或不表達(dá)eNOS,iNOS和 VEGF;eNOS表達(dá)陽性血管瘤標(biāo)本的MVD與表達(dá)陰性者差異無顯著性(P>0.05);iNOS表達(dá)陽性血管瘤標(biāo)本的MVD與表達(dá)陰性者差異有顯著性(P<0.05)。VEGF表達(dá)陽性血管瘤的MVD與表達(dá)陰性者差異有極顯著性(P<0.01)。
　　結(jié)論：i

3、NOS在VEGF的表達(dá)和調(diào)節(jié)血管生成過程可能起著重要作用;MVD隨著VEGF和iNOS表達(dá)的增強(qiáng)而增加,說明兩者對血管瘤血管生成具有促進(jìn)作用。
　　第二部分 VEGF反義寡核苷酸在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染
　　目的：觀察血管內(nèi)皮生長因子反義寡核苷酸(VEGF AS-ODN)在皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染及表達(dá)。
　　方法:體外培養(yǎng)皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞,并對其進(jìn)行鑒定;設(shè)計反義寡核苷酸(AS-ODN)、正義寡核苷酸(S-ODN

4、)和錯義寡核苷酸(MS-ODN),并對寡核苷酸堿基均進(jìn)行硫化修飾(PS-ODN),分析寡核苷酸在血清培養(yǎng)液中穩(wěn)定性;并將脂質(zhì)體介導(dǎo)的VEGF反義、正義及錯義寡核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染;采用MTT法測定各組細(xì)胞的增殖速度并繪制細(xì)胞生長曲線,并觀察VEGF反義寡核苷酸在不同時間點(24、48和72小時)對內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制,確定其最佳轉(zhuǎn)染時間和濃度;同時運用免疫組化技術(shù)檢測VEGF的蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:AS-ODN組細(xì)胞的生長受到明顯的

5、抑制,細(xì)胞數(shù)增加緩慢,抑制作用在48小時效果最顯著,抑制率達(dá)50％以上,在72 h后抑制作用逐漸減弱,且這種抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)(2.5~15μmol/L)呈劑量依賴性,其最佳濃度為5μmol/L,而作為對照的S-ODN組、MS-ODN組和空白對照組則抑制作用不明顯;免疫組化表明, AS-ODN作用后的皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞 VEGF蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降,且表達(dá)強(qiáng)度減弱,PI值明顯小于對照組,S-ODN組、MS-ODN組與空白對照

6、組間無明顯差別。
　　結(jié)論：VEGFAS-ODN能顯著抑制皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長,且于48小時作用最明顯,濃度為5μmol/L時作用最佳。
　　第三部分 VEGF反義寡核苷酸在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的：探討血管內(nèi)皮生長因子反義寡核苷酸(VEGF AS-ODN)作用后皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞 VEGF mRNA表達(dá)及培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌的改變。
　　方法：采用RT-PCR定量檢測各組皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中

7、VEGF mRNA含量的變化;ELISA檢測各組皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌的改變。
　　結(jié)果：用5μmol/L的SP-ODN作用48h后,RT-PCR結(jié)果顯示:VEGF AS-ODN處理組VEGFmRNA表達(dá)水平較空白對照組明顯下降,而S-ODN組、MS-ODN處理組與空白對照組比較,其 VEGF mRNA表達(dá)未見明顯改變。ELISA結(jié)果顯示:VEGF AS-ODN處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF蛋白分泌濃度較

8、空白對照組明顯下降,而S-ODN組、MS-ODN處理組與空白對照組比較VEGF濃度未見明顯變化。
　　結(jié)論：VEGF AS-ODN轉(zhuǎn)染可以有效地抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞 VEGFmRNA表達(dá)的含量,降低VEGF蛋白分泌,因而可以有效地抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長。
　　第四部分 VEGF反義寡核苷酸在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中生物學(xué)特性的檢測
　　目的：研究血管內(nèi)皮生長因子反義寡核苷酸(VEGF AS-ODN)對皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞體外生物

9、學(xué)特性的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞;脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF AS-ODN、S-ODN和MS-ODN進(jìn)行轉(zhuǎn)染;在5μmol/L濃度下作用48h后,通過流式細(xì)胞儀檢測VEGF AS-ODN、S-ODN、MS-ODN和空白對照組對皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：VEGF AS-ODN組皮膚血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在作用48h后,與S-ODN組、MS-ODN組及空白對照組相比,G0/G1期細(xì)胞增加,而S期和G2/