鉛對神經(jīng)細胞信號傳導(dǎo)通路中蛋白激酶C及鈣調(diào)蛋白表達影響的研究.pdf

1、目的：研究鉛對仔鼠海馬、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251中的蛋白激酶C(PKC)、鈣調(diào)蛋白(CaM)的mRNA和蛋白表達的影響，以進一步探討鉛神經(jīng)毒作用的分子機制，為鉛中毒的防治工作提供理論依據(jù)。 方法：1.鉛對仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)指標(biāo)的影響將孕鼠隨機分為去離子水對照組、0.2％醋酸鉛(Pb(Ac)2)和1％Pb(Ac)2組，從懷孕第0d起開始通過自由飲水染毒。幼鼠出生后，先通過哺乳接觸鉛，斷乳后則自行飲用與其母鼠濃度相同的含鉛水。出

2、生后(postnatal，PN)8d內(nèi)行懸崖回避實驗，PN50d行跳臺實驗，隨后處死仔鼠，原子吸收光譜法測定腦鉛含量，乙酰膽堿酯酯酶試劑盒測定乙酰膽堿酯酶活力，RT-PCR法和Western-blotting法觀察各組仔鼠海馬PKC、CaM的mRNA和蛋白表達情況；2.鉛對人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞U251細胞PKC、CaM表達的影響將U251細胞分為5×10-8、5×10-6、5×10-4mol/LPb(Ac)2染毒組和生理鹽水對照組，接種

3、密度為5.5×105個/ml，75cm2細胞培養(yǎng)瓶每瓶接種5ml，培養(yǎng)24h貼壁后染毒，染毒24h。MTT實驗觀察鉛對U251細胞存活率的影響，免疫細胞化學(xué)觀察PKC和CaM在細胞中的定性表達，RT-PCR和Westernblot方法檢測各組細胞中PKC和CaM的mRNA和蛋白表達水平。 結(jié)果：1.鉛對仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)指標(biāo)的影響：(1)染鉛組仔鼠的體重、身長均低于對照組(P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。(2)染鉛組PN

4、8d和PN50d的仔鼠腦鉛含量均高于對照組(P<0.01)，呈劑量反應(yīng)關(guān)系；同劑量組PN50d與PN8d的仔鼠相比，腦鉛含量明顯增加(P<0.01)。(3)染鉛組平面翻正反射完成率均低于對照組(P<0.01)，1％Pb(Ac)2組平面翻正反射完成率低于0.2％Pb(Ac)2組(P<0.01)。(4)染鉛組懸崖回避完成率均低于對照組(P<0.01)。1％Pb(Ac)2組懸崖回避完成率低于0.2％Pb(Ac)2組(P<0.01)。(5)鉛可

5、顯著降低仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，染鉛組仔鼠跳臺實驗反應(yīng)時間延長、潛伏期變短、錯誤次數(shù)顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。(6)PN8d1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的膽堿酯酶活力低于對照組(P<0.01)；PN50d的0.2％、1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的膽堿酯酶活力均低于對照組(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。(7)PN8d和PN50d的1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的PKCmRNA相對表達量均低

6、于對照組(P<0.05，P<0.01)，0.2％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的PKCmRNA相對表達量與對照組比較差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PN50d與PN8d相比，1％Pb(Ac)2組PKCmRNA表達有下降趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(8)PN8d和PN50d的0.2％、1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬PKC蛋白相對表達量與對照組比較表達均降低(P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。PN50d與PN8d相比，1％Pb

7、(Ac)2組PKC蛋白表達有下降趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(9)PN8d的1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaMmRNA相對表達量低于對照組(P<0.05)，但0.2％Pb(Ac)2組與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PN50d的0.2％和1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaMmRNA表達均低于對照組(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。PN50d與PN8d相比，1％Pb(Ac)2組CaMmRNA表達

8、有下降趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(10)PN8d1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaM蛋白相對表達量與對照組比較表達降低(P<0.01)，而0.2％Pb(Ac)2組與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PN50d的0.2％、1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaM蛋白相對表達量與對照組比較均降低(P<0.05，P<0.01)，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。PN50d與PN8d相比，0.2％、1％Pb(Ac)2組CaM蛋白表達均有下降

9、趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；2.鉛對U251細胞中PKC、CaM表達的影響：(1)5×10-6、5×10-5和5×10-4mol/LPb(Ac)2組的細胞存活率與對照組相比均降低(P<0.01)，且隨劑量的增加存活率下降。(2)細胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，PKC、CaM在U251細胞的胞質(zhì)中均有表達。且隨劑量的增加，陽性表達細胞率均下降。(3)5×10-4mol/LPb(Ac)2組PKCmRNA相對表達量低于對照組(P<0.0

10、5)；而5×10-8、5×10-6Pb(Ac)2組PKCmRNA相對表達量與對照組比較沒有減少(P>0.05)。5×10-8、5×10-6、5×10-4mol/LPb(Ac)2組PKC蛋白相對表達量均低于對照組(P<0.01)，且隨劑量的增加蛋白表達降低。(4)5×10-8、5×10-6、5×10-4Pb(Ac)2組的CaMmRNA和蛋白相對表達量均低于對照組(P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。 結(jié)論：1.通過孕期和哺乳期對母鼠

11、染毒，鉛可以在仔鼠的腦部蓄積；使仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降；降低膽堿酯酶的活力；使不同發(fā)育時期的仔鼠海馬部位的PKC、CaM的mRNA和蛋白表達均降低，可能是鉛影響仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機制之一；2.鉛可以影響U251細胞的生長，使細胞存活率下降；使U251細胞中的PKC、CaM的mRNA和蛋白表達均降低，可能是鉛對人體的神經(jīng)毒性的機制之一。綜上，動物實驗與細胞學(xué)實驗的結(jié)果一致。提示鉛對信號傳導(dǎo)通路中PKC、CaM的影響可能是其神經(jīng)毒性的機制之