丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉通過抑制鈣調蛋白激酶Ⅱ對房顫的影響.pdf

1、目的:在正常生理情況下，心肌細胞興奮，細胞外鈣離子通過L型鈣通道(L-type calcium channels，LTCC)進入細胞后激活肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)膜上的雷諾丁受體2(ryanodine receptor2，RyR2)，使SR內鈣離子大量釋放，觸發(fā)興奮一收縮偶聯(lián)。隨著鈣離子濃度升高，SR膜上鈣泵激活，細胞基質中的大部分鈣離子通過鈣泵回收入SR。同時，細胞膜上的鈉鈣交換體將少部分鈣離子轉運

2、到細胞外。如果上述過程出現(xiàn)異常會使細胞內鈣穩(wěn)態(tài)破壞，鈣分布不平衡，細胞內鈣離子濃度異常升高，即為細胞內鈣超載。鈣調蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CaMKⅡ)是一種絲氨酸磷酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在四種亞型（α、β、γ、δ），廣泛分布于人體組織中，其中δ亞型主要存在于心肌細胞，其可以磷酸化LTCC，RyR2，基質網(wǎng)鈣離子受體2a抑制蛋白（SERCA2a-inhibitor

3、y protein phospholamban，PLN）與細胞內鈣轉運相關的諸多蛋白，從而調節(jié)細胞內鈣離子濃度。若心肌細胞CaMKⅡ表達上調、活性增強，CaMKⅡ磷酸化多種鈣轉運蛋白，細胞內鈣離子濃度異常，可引起心肌電重構，縮短動作電位時程和QT間期，并導致平臺期穩(wěn)定性受損，使心肌細胞發(fā)生后去極化，誘導心律失常。心房顫動(AtrialFibrillation，AF)，簡稱房顫，是臨床上最常見的快速性心律失常之一。目前研究表明，房顫病人心

4、房肌細胞CaMKⅡ表達上調，且RyR2和PLN磷酸化增加。CaMKⅡ抑制劑可降低房顫患者心房肌增加的持續(xù)性電火花，顯著減少房顫的發(fā)生。因此，認為CaMKⅡ可能是治療房顫的靶點之一。丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉(DS-201)是丹參主要成分丹參酮的一種水溶性鹽化物，目前已用于心血管疾病的臨床治療。有研究表明DS-201可以通過抑制LTCC使鈣內流減少，但具體機制仍未闡明。本實驗擬在新生大鼠心肌細胞快速起搏模型上探討DS-201是否對CaMKⅡ產生影

5、響，以及DS-201是否對犬房顫模型產生作用，從而為進一步探討DS-201對房顫的治療提供更多實驗依據(jù)。
　　方法:(1)新生大鼠心房肌原代培養(yǎng):選取新生SpragueDawley(SD)大鼠（1-3天）。無菌條件下，固定四肢，用鑷子從劍突下方成V字剪開皮膚，于肋弓正中偏左開胸，從心底部夾取心臟，放入盛有PBS的P10培養(yǎng)皿中，將沖洗后的心臟移至新的培養(yǎng)皿中，在放大鏡下找到左、右心耳，PBS清洗2次，收集至玻璃培養(yǎng)瓶中，加入胰蛋白

6、酶，4度靜置過夜，12-16h后終止胰蛋白酶的消化，用膠原酶進一步消化，收集心房肌細胞接種于P10培養(yǎng)皿，37℃、5％ CO2差速貼壁1.5 h，收集細胞懸液均勻接種于6孔板，細胞個數(shù)約1×104/cm2，并加入Brdu(100∶1)，37℃、5％CO2培養(yǎng)，每24 h換液一次。心肌細胞鑒定后，隨機分為5組:對照組;快速起搏組:給予細胞大小為10V、頻率10Hz、時長為24 h的電刺激;低濃度干預組:給予細胞電刺激的同時加入DS-201

7、，藥物終濃度為10μM;中濃度干預組:給予細胞電刺激的同時加入DS-201，藥物終濃度為50μM;高濃度干預組:給予細胞電刺激的同時加入DS-201，藥物終濃度為100μM。(2) Western blotting實驗:利用試劑盒提取原代培養(yǎng)心房肌總蛋白，根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒指示，測定蛋白質濃度，通過SDS-PAGE電泳使不同分子量的蛋白分離，將蛋白轉移至PVDF膜上，一抗孵育4℃過夜，二抗孵育1h后，加入顯色劑后成像并分析處理

8、所得圖像。檢測電刺激前后以及干預前后CaMKⅡ蛋白的表達和287號位蘇氨酸(Thr287)磷酸化（PThr287-CaMKⅡ）蛋白水平。(3) RT-PCR實驗:根據(jù)RNA提取試劑盒說明，提取大鼠原代培養(yǎng)心房肌細胞中的總RNA，檢測濃度以及純度;按照逆轉錄試劑盒，將mRNA逆轉錄為cDNA，采用SYBR GreenⅠ法實時熒光定量PCR檢測快速起搏前后以及DS-201干預前后CaMKⅡ mRNA水平的差異。(4)犬房顫模型建立:房顫組為

9、犬麻醉消毒鋪巾后，記錄心電圖后心內起搏，以周長100 ms，2倍的閾值刺激電壓為輸出電壓刺激心房，快速心房起搏5～30 min，房顫圖形出現(xiàn)，持續(xù)6h，停止電刺激，記錄犬1h內心電圖改變。干預組為房顫模型成功建立后，DS-201靜脈推注2.66mg/kg體重，持續(xù)記錄心電圖1h。
　　結果:(1)快速起搏對乳鼠CaMKⅡ的影響:快速起搏組與對照組相比總蛋白明顯升高(P＜0.01)，磷酸化蛋白升高（P＜0.01）。以對照組為參考，標

10、準化后快速起搏組CaMKⅡ蛋白與PThr287-CaMKⅡ蛋白無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，電刺激組mRNA高于對照組(P＜0.01)。(2) DS-201對CaMKⅡ的影響:與快速起搏組相比，低濃度干預組、中濃度干預組、高濃度干預組CaMKⅡ蛋白與基因表達量明顯降低(P＜0.01)，中濃度干預組低于低濃度干預組(P＜0.01)，高濃度干預組低于中濃度干預組(P＜0.01)，高濃度干預組與對照組無差異(P＞0.05)。與快速起搏組相比，

11、低濃度干預組PThr287-CaMKⅡ蛋白降低(P＜0.01)，與對照組相比，低濃度干預組PThr287-CaMKⅡ蛋白降低（P＜0.05）。(3) DS-201對犬房顫的影響:相對于犬房顫組，干預組顫持續(xù)時間縮短(P＜0.01)和房顫發(fā)生次數(shù)較少(P＜0.01)。
　　結論:(1)CaMKⅡ參與房顫的發(fā)生。(2)DS-201可以降低房顫的發(fā)生頻率以及持續(xù)時間。(3)DS-201可能通過抑制CaMKⅡ基因、蛋白表達以及活性，對房顫