精氨酸血管加壓素通過鈣離子依賴性蛋白激酶C信號傳導途徑增強T型鈣電流.pdf

1、目的：精氨酸血管加壓素（arginine vasopressin，AVP），是一種九肽神經(jīng)垂體激素，由下丘腦的視上核和室旁核分泌，目前已經(jīng)作為血管收縮劑用于心臟驟停急救及嚴重創(chuàng)傷休克后血管低反應性的恢復中，由于AVP V2受體拮抗劑具有高選擇性,排水不排鈉,能夠增加自由水的排除而對電解質(zhì)沒有明顯影響，因此其已應用于心衰引起的低鈉血癥治療中，另外 AVP可以誘導 V1a受體促進心肌成纖維細胞轉化為分泌更強的肌成纖維細胞，引起心肌纖維化，多

2、種研究證實了AVP可以調(diào)節(jié)L型離子通道， KCNQ鉀通道等導致心律失常作用。本實驗室既往研究已證明在急性和慢性作用時，AVP均可增加T型鈣電流，但是關于AVP對T型鈣通道作用機制尚未完全闡明。本研究使用全細胞膜片鉗技術從鈣敏感性調(diào)節(jié)分子PKC途徑入手研究其機制。主要內(nèi)容包括三部分:①進一步明確AVP對T型鈣電流的作用;②AVP調(diào)節(jié)T型鈣電流的作用與細胞內(nèi)鈣離子濃度的關系;③AVP通過鈣離子依賴性PKC信號傳導途徑增強T型鈣電流。

3、　　方法：
　　1.制備和培養(yǎng)新生SD大鼠心室肌細胞
　　實驗中使用1-3天內(nèi)的新生SD大鼠制備原代新生乳鼠心肌細胞，經(jīng)酶解法分離，將心肌細胞接種于35mm含10％牛血清的培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)皿中并置于37℃含5%CO2/95%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約12-24小時間后進行細胞電生理記錄。
　　2.全細胞模式電流記錄
　　L型鈣離子電流和 T型鈣電流使用全細胞模式記錄，室溫條件為（20℃-23℃），電極外液（mmol/L

4、）：氯化四乙銨（TEA）-Cl136， CaCl22， MgCl22，HEPES25，葡萄糖20，TEA-OH調(diào)節(jié)pH為7.3。根據(jù)Fabiato方程式電極內(nèi)液（mmol/L）設置為五種不同的鈣離子濃度：CsCl130， Mg-ATP2，HEPES25，Cs-OH調(diào)節(jié)pH為7.3（鈣離子濃度如表1溶液A， B，C，D，和 F）。玻璃微電極注入電極內(nèi)液后阻抗達4-6MΩ。L型+T型鈣電流的測定設計為：維持電位為-100mV，測試電位為-9

5、0mV至+50mV，階躍電壓10mV，步寬300ms。L型鈣電流的測定設計為：維持電位為-50mV，測試電位為-40mV至+50mV，階躍電壓10mV，步寬300ms。
　　本研究采用同一細胞藥物刺激前后自身對照的方法，記錄300nM AVP對SD大鼠心肌細胞T型鈣通道的影響：①使用不同鈣離子濃度的電極內(nèi)液（pCa=7 pCa=8 pCa=9 pCa=10 pCa=11）記錄未加入AVP時的鈣電流作為正常對照組，隨后加入300nM

6、 AVP，5分鐘后在次記錄鈣電流記錄作為實驗組。②本研究為進一步探討AVP對ICa.T的作用機制，使用蛋白激酶抑制劑（蛋白激酶A,PKA抑制劑、PKC抑制劑、蛋白激酶G,PKG抑制劑、鈣調(diào)蛋白II,CaMkII抑制劑、細胞外相關信號傳導激酶抑制劑）對細胞培養(yǎng)1小時后，在含有生理狀態(tài)的鈣離子濃度pCa=7.2細胞外液中，記錄AVP作用前后T型鈣通道電流的變化。
　　3.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法
　　數(shù)據(jù)經(jīng)膜片鉗放大器（HEKA EP

7、C10，德國）采集，數(shù)據(jù)用mean± SE表示，相同鈣離子濃度實驗組采用 t檢驗進行分析加藥前后兩組，不同鈣離子濃度實驗組使用多因素試驗資料的方差分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.AVP能夠增加T型鈣電流這一作用受細胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)。
　　當pCa=11時，300nM AVP實驗組和正常對照組相比。T型鈣電流增加幅度為（9.63±0.83）%（n=12，P<0.05～0.01）;當pCa=10

8、時，300nM AVP實驗組和正常對照組相比，T型鈣電流增加幅度為（27.83±2.43）%（n=12，P<0.01）;當pCa=9時，300nM AVP實驗組和正常對照組相比， T型鈣電流增加幅度為（33.28±4.90）%（n=13，P<=0.001）;當pCa=8時，300nM AVP實驗組和正常對照組相比，T型鈣電流增加幅度為（37.30±3.36）%（n=10，P<0.05）;當pCa=7時，300nM AVP實驗組和正常對照

9、組相比，T型鈣電流增加幅度為（39.75±4.41）%（n=12，P<0.05～0.01）。
　　由此可見當細胞內(nèi)液鈣離子濃度為pCa7時， T型鈣通道電流明顯增加，而當細胞內(nèi)液鈣離子濃度為pCa11時， T型鈣電流增加不明顯，當對 pCa=7時和 pCa=11時 AVP對 T型鈣電流增加幅度進行統(tǒng)計學分析P<=0.001這些數(shù)據(jù)表明隨著細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加AVP對心肌細胞T型鈣電流增強作用更加明顯。AVP對T型鈣電流調(diào)控作用依

10、賴細胞內(nèi)液鈣離子濃度的變化。
　　2.AVP可能通過鈣依賴性PKC信號傳導途徑增強T型鈣電流。
　　為進一步探討AVP對ICa.T的作用機制，使用蛋白激酶抑制劑對細胞培養(yǎng)1小時后，在含有生理狀態(tài)的鈣離子濃度pCa=7.2細胞外液中，記錄AVP作用前后T型鈣通道電流的變化。
　　對照組為300nM AVP，pCa=7.2, ICa.T增加38.67±8.74%;加入H-89（蛋白激酶A, PKA抑制劑10κmol/L）,

11、 AVP作用下ICa.T增加36.06±7.18%;加入白屈菜赤堿（PKC抑制劑5κmol/L） AVP作用下 ICa.T增加14.68±5.21%。加入KT5823（蛋白激酶G, PKG抑制劑1κmol/L）, AVP作用下ICa.T增加37.87±6.36%。加入KN-62（鈣調(diào)蛋白II，CaMKII抑制劑3κmol/L），AVP作用下ICa.T增加39.9±7.26%，加入PD98059（細胞外相關信號傳導激酶抑制劑10κmol/