環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)精子運(yùn)動(dòng)功能調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、精子活力低下是男性不育癥的常見(jiàn)病因之一，精子跨膜細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)與精子的活力密切相關(guān)，不同的細(xì)胞信號(hào)通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路引起精子鞭毛蛋白的磷酸化或去磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)精子的活力?？赡苷{(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路有多種，如二酰甘油/蛋白激酶C(DG/PKC)通路以及鈣通道等。部分研究表明蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)介導(dǎo)的cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)精子活力有重要影響，目前對(duì)cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路研究的較為深入。PKA

2、是cAMP/PKA通路中的關(guān)鍵分子，是細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)中的重要一環(huán)。在多種哺乳動(dòng)物精子實(shí)驗(yàn)中，腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase，AC)激活劑及PKA激活劑都能提高精子的活力。 雖然有許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示cAMP/PKA通路參與調(diào)節(jié)精子的活力，但也有一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果不支持這一點(diǎn)，目前仍存在著爭(zhēng)議。雙丁酰環(huán)磷酸腺苷(dibutyrylcyclicadenosinemonophosphate，dbcAMP)是一種經(jīng)典的cAMP類

3、似物，同cAMP一樣能激活PKA，產(chǎn)生與cAMP類似的生物學(xué)效應(yīng)。弗司扣林(forskolin)來(lái)自毛喉鞘蕊花中提取的一種毛喉素，是磷酸二酯酶PDE的抑制劑。Forskolin能抑制cAMP的分解，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，增強(qiáng)cAMP所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。目前在forskolin增強(qiáng)精子的授精能力及項(xiàng)體反應(yīng)方面研究的較多，而在對(duì)精子活力的影響方面尚缺乏深入的研究報(bào)道。為了進(jìn)一步證實(shí)cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)功能的影響，我們

4、選擇不同濃度的dbcAMP和Forskolin體外分別與經(jīng)上游優(yōu)化處理的生育男性的精子一起孵育不同時(shí)間，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助的精子分析(Computeraidedspermanalysis，CASA)分析其對(duì)精子不同運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響，結(jié)果顯示：0.1、0.5和1.0mmol/L的dbcAMP以及0.01、0.1和1.0mmol/L的forskolin與對(duì)照組相比都能明顯提高精子的活率及前向性運(yùn)動(dòng)百分率(P＜0.001)，而對(duì)直線速度VSL和曲線

5、速度VCL無(wú)明顯影響(p＞0.05)。相關(guān)性分析表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，精子的活率及前向性運(yùn)動(dòng)百分率與dbcAMP和forskolin的濃度都呈正相關(guān)。而在1h內(nèi)，精子運(yùn)動(dòng)各參數(shù)無(wú)明顯變化。結(jié)果說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)dbcAMP和forskolin在體外能提高人精子的運(yùn)動(dòng)功能，此結(jié)果為證實(shí)cAMP/PKA信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)人精子運(yùn)動(dòng)功能提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 A激酶錨定蛋白(A-kinaseanchorproteins，AKAPs

6、)是cAMP介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)中一類十分重要的蛋白質(zhì)分子。AKAPs主要通過(guò)特異性結(jié)合PKA，使PKA錨定于作用底物附近，催化靶蛋白磷酸化從而傳遞細(xì)胞信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)。眾多試驗(yàn)研究表明AKAP82是將PKA錨定于精子鞭毛通過(guò)催化鞭毛蛋白磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)精子的運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵蛋白，那么精子活力低下是否由于AKAP82的表達(dá)異常所引起?為了證實(shí)上述假說(shuō)，我們選用AKAP82的前體pro-AKAP82第131～145氨基酸形成的多肽作為抗原決定簇

7、制作抗血清，利用Western印跡和免疫熒光檢測(cè)分析活力低下精子的AKAP82是否異常，并與正常精子作對(duì)照。結(jié)果表明對(duì)照組在免疫熒光中出現(xiàn)精子鞭毛熒光染色，并且絕大部分在WesternBlot中檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為97000和18000的兩條蛋白條帶，而試驗(yàn)組有2例樣本既沒(méi)有在WesternBlot中檢測(cè)出任何蛋白條帶顯色，也沒(méi)有在免疫熒光中出現(xiàn)精子鞭毛熒光染色，9例樣本在免疫熒光中出現(xiàn)精子鞭毛正常熒光染色，但在WesternB