IPO11高表達在膀胱尿路上皮癌進展中的作用及其機制研究.pdf

1、[背景] 膀胱尿路上皮癌仍是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，可分為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)。在初診的膀胱癌病人中，70％-80％為NMIBC病人，一般采用經(jīng)尿道腫瘤電切等微創(chuàng)手術(shù)方法治療，如腫瘤無進展，其預(yù)后良好。但是，約30％的NMIBC會進展為MIBC，此時即便采用膀胱全切+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，2年內(nèi)仍有約50％的MIBC病人會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，患者的3年生存率小于50％，預(yù)后差。但是，目前臨床上缺

2、乏預(yù)測NMIBC進展風(fēng)險的分子標(biāo)志物，更缺乏阻斷膀胱癌進展的靶向藥物。因此，針對膀胱癌侵襲進展的分子機制研究意義重大，十分必要。
　　IPO11基因的編碼蛋白importin-11是胞質(zhì)核轉(zhuǎn)運受體(karyopherins)家族中的一員，可特異性介導(dǎo)生物大分子經(jīng)核孔復(fù)合體入核。近來證據(jù)顯示，蛋白、核酸等大分子物質(zhì)在胞質(zhì)和核質(zhì)之間的穿梭不僅是維持細胞正常結(jié)構(gòu)的需要，更是調(diào)控細胞生物學(xué)行為的方式之一，也與腫瘤的進展關(guān)系密切，而胞質(zhì)核轉(zhuǎn)

3、運受體是調(diào)控核轉(zhuǎn)運過程的重要節(jié)點，其表達水平異常顯示與腫瘤的發(fā)生和進展關(guān)系密切，但目前尚無IPO11與腫瘤方面的研究。
　　前期對3例MIBC單個腫瘤突入膀胱腔內(nèi)的腫瘤頂端的淺表腫瘤部分和浸潤粘膜下層和肌層的基底腫瘤部分以及相應(yīng)遠離腫瘤的正常膀胱粘膜的基因組DNA進行了外顯子組測序研究，結(jié)果顯示在3例MIBC中的2例基底腫瘤相對其淺表腫瘤存在IPO11基因拷貝數(shù)增加，推測MIBC基底腫瘤中IPO11拷貝數(shù)增加及其可能引起的PO11

4、高表達與膀胱癌的侵襲進展有關(guān)。
　　[目的]探討IPO11高表達在膀胱尿路上皮癌侵襲進展中的作用及其可能的分子機制。
　　[材料和方法]
　　1.提取3例MIBC淺表腫瘤、基底腫瘤和相應(yīng)遠離腫瘤的正常膀胱粘膜的基因組DNA進行外顯子組測序。
　　2.通過實時定量PCR(real-time qPCR)方法對測序樣本及25例接受膀胱癌根治術(shù)的膀胱腫瘤的淺表腫瘤部分及其癌旁正常粘膜進行IPO11絕對拷貝數(shù)檢測。

5、　　3.通過熒光原位雜交(FISH)方法對上述25例膀胱腫瘤組織石蠟切片進行IPO11拷貝數(shù)檢測。
　　4.通過Real-time qPCR方法對上述25例膀胱腫瘤及其癌旁正常粘膜進行IPO11 mRNA相對表達量檢測，分析IPO11拷貝數(shù)和mRNA表達量的關(guān)系。
　　5.通過免疫組化方法對接受膀胱癌根治術(shù)的134例病人（包括3例測序病人及IPO11拷貝數(shù)變異檢測的25例病人）的腫瘤組織石蠟切片和10例正常膀胱粘膜的組織石蠟

6、切片中importin-11的表達進行檢測，比較importin-11在正常膀胱粘膜及膀胱腫瘤組織中的表達差異，分析importin-11表達與IPO11拷貝數(shù)以及IPO11 mRNA表達量的關(guān)系，以及importin-11表達與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系和對生存預(yù)后的影響。
　　6.通過Real-time qPCR方法檢測8株膀胱癌細胞株IPO11 mRNA的相對表達量。
　　7.通過RNA干擾方法敲減膀胱癌細胞EJ和5637的I

7、PO11基因，通過CCK-8實驗，細胞劃痕實驗，Transwell遷移和侵襲實驗，流式細胞術(shù)細胞凋亡和細胞周期檢測的方法，檢測下調(diào)IPO11表達對這兩種膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響和對細胞凋亡和細胞周期分布的影響。
　　8.通過在EJ細胞裸鼠皮下移植瘤內(nèi)注射膽固醇修飾的IPO11 siRNA進行體內(nèi)RNA干擾實驗，觀察下調(diào)IPO11對移植瘤生長的影響。
　　9.在野生型EJ細胞和IPO11敲減的EJ細胞中提取細胞總R

8、NA，進行轉(zhuǎn)錄組測序及顯著差異表達基因的KEGG pathway分析。
　　10.在野生型EJ細胞和IPO11敲減的EJ細胞中，通過Real-time qPCR方法檢測轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)的Bladder cancer通路中顯著差異表達基因mRNA的相對表達量。
　　[結(jié)果]
　　1.3例外顯子組測序的MIBC組織中的2例基底腫瘤相對其淺表腫瘤出現(xiàn)IPO11基因拷貝數(shù)增加。Real-time qPCR和石蠟切片F(xiàn)ISH的檢測

9、結(jié)果均驗證了外顯子組測序?qū)PO11拷貝數(shù)的分析結(jié)果，并顯示25例膀胱淺表腫瘤有10例存在IPO11拷貝數(shù)增加，6例存在IPO11拷貝數(shù)減少，IPO11拷貝數(shù)變異率為64.0％(16/25)，而且IPO11拷貝數(shù)與IPO11 mRNA及蛋白表達量相關(guān)。
　　2.Importin-11在正常膀胱粘膜中的陽性表達率為50％(5/10)，均為細胞質(zhì)內(nèi)弱陽性表達，高表達率為0％;在膀胱癌中的陽性表達率為85.8％(115/134)，高表達

10、率為64.9％(87/134)，細胞核內(nèi)陽性表達率為24.6％(33/134)，其陽性表達率和高表達率顯著高于正常粘膜中的表達率。134例膀胱癌免疫組化結(jié)果顯示importin-11高表達與膀胱癌的高分期、高分級、淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，importin-11高表達組膀胱癌患者的3年總生存率，腫瘤特異生存率和無腫瘤生存率均顯著降低，importin-11高表達還是膀胱癌病人腫瘤特異生存率和無腫瘤生存率降低的獨立危險因子。
　　

11、3.Real-time qPCR檢測非浸潤性膀胱癌細胞株BIU-87和乳頭狀膀胱癌細胞株RT4的IPO11 mRNA表達量低，而6株浸潤性膀胱癌細胞株T24，5637，UM-UC-3， J82，HT1376，EJ的IPO11 mRNA表達量顯著升高。
　　4.劃痕實驗和Transwell遷移實驗中，敲減IPO11基因后EJ和5637細胞的遷移能力顯著下降;Transwell侵襲實驗中，敲減IPO11基因可以顯著抑制EJ和5637細

12、胞的侵襲能力。CCK-8實驗結(jié)果顯示與陰性對照組相比，下調(diào)IPO11顯著降低了EJ細胞的增殖能力，對5637細胞的增殖能力沒有顯著影響。與陰性對照組相比，下調(diào)IPO11顯著促進了5637細胞的凋亡，對EJ細胞的凋亡無顯著影響。下調(diào)IPO11對EJ和5637細胞的細胞周期分布均無顯著影響。體內(nèi)RNA干擾實驗中，與對照組相比IPO11敲減實驗組的平均腫瘤體積和平均腫瘤重量均有下降，但均沒有顯著性差異。
　　5.對野生型EJ細胞和IPO

13、11敲減的EJ細胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)有22個顯著差異表達基因，對這些基因進行KEGG pathway分析，結(jié)果顯示涉及包括Bladder cancer通路在內(nèi)的多種腫瘤相關(guān)信號通路。Bladder cancer通路中的CDKN1A和THBS1基因表達顯著下調(diào)，并通過qPCR實驗在野生型EJ細胞和IPO11敲減的EJ細胞中得到了驗證。
　　[結(jié)論]IPO11的編碼蛋白importin-11在人類膀胱尿路上皮癌組織中相較正常膀胱粘膜顯著高