微絲相關(guān)蛋白hHBrk1在腫瘤組織中的表達(dá)及其與肌球蛋白Ⅵ相互作用的初步研究.pdf

1、人同源BrckI基因(hHBrkl)是本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)從人支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系BERP35中克隆到的差異表達(dá)基因。由于與玉米的Brickl有高度同源性，因此命名為hHBrkl。hHBrkl在動(dòng)植物界高度保守，編碼一種微絲相關(guān)蛋白，參與微絲的聚合。hHBrkl基因(GenBank：AYl48219)，又名HSPC300、C30RF10及MDS027，位于3號(hào)染色體短臂25.3-24.1區(qū)，與抑癌基因VHL鄰近，由3個(gè)外顯

2、子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，編碼75個(gè)氨基酸殘基，分子量約9 Kd。hHBrkl能與Rho GTP酶的效應(yīng)分子WAVEl的SHD區(qū)相互作用，參與微絲成核作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。hHBrkl蛋白家族在第47～67位氨基酸殘基存在一個(gè)七重復(fù)(Heptaedrepeat,HR)結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可形成特殊的卷曲螺旋，是介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的重要結(jié)構(gòu)。前期的研究表明hHBrkl可能通過(guò)促進(jìn)微絲的異常聚合參與腫瘤的遷移。 本研究的第一階段首先利用組織譜

3、陣列芯片技術(shù)構(gòu)建了hHBrkl在多腫瘤及癌旁正常組織差異表達(dá)譜。篩選出了hHBrkl基因表達(dá)上調(diào)的肺癌組織和表達(dá)下調(diào)的腎癌組織。接著，通過(guò)半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)8對(duì)16例肺癌及癌旁正常組織的hHBrkl基因表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了hHBrkl在肺癌與癌旁正常組織中的差異表達(dá)。第二階段，以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pGEX4T-hHBrkl為基礎(chǔ)，原核表達(dá)了融合蛋白GST-hHBrkl，運(yùn)用GST-pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)合蛋白質(zhì)肽指紋質(zhì)譜分析技術(shù)

4、得到了hHBrkl相互作用蛋白質(zhì)肌球蛋白Ⅵ。肌球蛋白Ⅵ屬于肌球蛋白超家族成員，Yoshida發(fā)現(xiàn)肌球蛋白Ⅵ基因高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞容易向腹腔播散；而微絲聚合促進(jìn)因子WAVE2則與黑色素瘤的浸潤(rùn)表型有關(guān)，該結(jié)果提示hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ相互作用形成復(fù)合物可能與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，我們構(gòu)建了hHBrkl原核表達(dá)載體pGBTNH-hHBrkl并獲得了融合蛋白His-hHBrkl在大腸桿菌中高效表達(dá)

5、。并以此為基礎(chǔ)，在95D細(xì)胞的裂解液中完成了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ的免疫共沉淀，驗(yàn)證了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ的相互作用。運(yùn)用激光共聚焦技術(shù)，觀察到了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ共定位于95D細(xì)胞的胞漿。第三階段，分別構(gòu)建了hHBrkl的突變?nèi)笔w和肌球蛋白Ⅵ的各功能區(qū)截短體，在原核和真核獲得了融合蛋白的表達(dá)，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)鑒定了hHBrkl與肌球蛋白Ⅵ的作用位點(diǎn)位于肌球蛋白Ⅵ的卷曲螺旋區(qū)(Coiled-coil)、球狀區(qū)(Globu