人EBI3蛋白及其突變體與Sedlin蛋白的相互作用的初步研究.pdf

1、目的：在生物信息學(xué)分析人EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene3）蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建、GST pulldown、共聚焦免疫熒光和免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究了人EBI3蛋白及其突變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)、定位差異及其原因，以及與 Sedlin蛋白在體外及哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的相互作用，了解氨基酸序列中信號(hào)肽的存在對(duì)EBI3蛋白細(xì)胞定位的影響，探討EBI3蛋白與Sedlin蛋白發(fā)生相互作用的具體結(jié)構(gòu)域

2、位置，以及Asp210定點(diǎn)突變對(duì)EBI3蛋白與Sedlin蛋白之間相互作用的影響。
　　方法：基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人 EBI3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽的生物學(xué)分析。采用 PCR的方法，采用含人 EBI3全長(zhǎng)的 cDNA序列的質(zhì)粒pCDGFP-EBI3為模板，分別擴(kuò)增野生型人 EBI3及其缺失突變體 EBI3(1-135)、EBI3(125-230)的序列，酶切凝膠電泳回收目的片段后，插入到酵母表達(dá)載體pGADT7、pGB

3、KT7上，構(gòu)建出人EBI3及其缺失突變體的酵母表達(dá)載體質(zhì)粒；用同種方法構(gòu)建出真核表達(dá)載體質(zhì)粒 pCDNA3.1-EBI3-FLAG、pCDNA3.1-EBI3(1-135)-FLAG、 pCDNA3.1-EBI3(125-230)-FLAG以及 pCDGFP-EBI3(1-135)、pCDGFP-EBI3(125-230)。用 PCR方法，設(shè)計(jì)含特定位點(diǎn)突變的引物，以pCDNA3.1-EBI3-FLAG為模板，構(gòu)建將人EBI3的210位

4、天冬氨酸突變?yōu)楸彼岬?EBI3 Asp210真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-EBI3-D210A-FLAG。分別將下游帶FLAG標(biāo)簽的 pCDNA3.1-EBI3-FLAG、 pCDNA3.1- EBI3(1-135)-FLAG、pCDNA3.1-EBI3(125-230)-FLAG和pCDNA3-EBI3-D210A-FLAG四種質(zhì)粒單獨(dú)或與pCDGFP-Sedlin共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞中，用熒光共聚焦顯微鏡觀察EBI3蛋白及其突變

5、體的各自細(xì)胞定位，以及與 Sedlin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位，比較它們表達(dá)定位的差異。運(yùn)用GST-Sedlin融合蛋白及GST Pull-down技術(shù)檢測(cè)EBI3蛋白及其缺失突變體與Sedlin蛋白在體外相互作用的情況。將帶有FLAG標(biāo)簽的人EBI3及其突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒與pCDGFP-Sedlin共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，采用免疫共沉實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)人 EBI3及其突變體蛋白與Sedlin蛋白的相互作用情況。采用內(nèi)

6、源性免疫共沉淀技術(shù)，檢測(cè)人類(lèi)胎盤(pán)組織中的EBI3與Sedlin蛋白在自然情況下是否有相互作用的情況發(fā)生。
　　結(jié)果：通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出人EBI3的FN3結(jié)構(gòu)域和位置；用SignalP4.1 Server預(yù)測(cè)了EBI3蛋白的信號(hào)肽、信號(hào)肽切割位點(diǎn)；酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒均正確構(gòu)建；Western blotting結(jié)果顯示帶FLAG標(biāo)簽的重組蛋白均能在HEK293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)；GST Pull-down實(shí)驗(yàn)證明野生型人E

7、BI3蛋白及突變體除了羧基端截短體EBI3(125-230)外，均與Sedlin蛋白存在相互作用。用共聚焦熒光顯微鏡觀察，野生型人 EBI3蛋白及其突變體在 COS7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核與核膜上均有表達(dá)，但是表達(dá)量有差異，顯示EBI3野生型及其缺失突變體在COS7細(xì)胞中的定位發(fā)生明顯變化，而定點(diǎn)突變體 pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG的定位與野生型類(lèi)似。免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)顯示EBI3及其突變體與Sedlin均存在不同位置

8、的共定位現(xiàn)象；外源性的免疫共沉淀（co-IP）實(shí)驗(yàn)表明野生型人EBI3及其突變體與Sedlin蛋白都存在相互作用；內(nèi)源性co-IP亦證明了天然存在的EBI3和Sedlin蛋白存在相互作用。
　　結(jié)論：在 COS7細(xì)胞中EBI3及其突變體與Sedlin均存在不同位置共定位現(xiàn)象；EBI3 Asp210突變對(duì)人EBI3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位影響甚微；GST Pull-down實(shí)驗(yàn)證明野生型人 EBI3蛋白及突變體除了羧基端截短體 EBI3(