E2F1蛋白與Sedlin蛋白相互作用的初步探討.pdf

1、目的：初步探討E2F1蛋白和Sedlin蛋白在體內(nèi)體外有無(wú)相互作用，進(jìn)而為遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良(SEDT)的靶向治療提供新的思路。
　　方法：以含人E2F1全長(zhǎng)cDNA序列的質(zhì)粒為模板，用常規(guī)PCR擴(kuò)增E2F1，構(gòu)建pcDNA3.1-E2F1-FLAG真核表達(dá)載體，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序。將pcDNA3.1-E2F1-FLAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，同時(shí)制備GST-Sedlin融合蛋白，通過(guò)GST Pull-dow

2、n技術(shù)檢測(cè)E2F1蛋白與Sedlin蛋白在體外有無(wú)相互作用。將pcDNA3.1-E2F1-FLAG和pCDGFP-Sedlin分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中，觀察兩者在細(xì)胞內(nèi)的定位現(xiàn)象，將pcDNA3.1-E2F1-FLAG與pCDGFP-Sedlin一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中，觀察兩者在細(xì)胞內(nèi)的共定位現(xiàn)象。將pcDNA3.1-E2F1-FLAG和pCDGFP-Sedlin瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)E2F1

3、與Sedlin蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有無(wú)相互作用。
　　結(jié)果：酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果都證明了pcDNA3.1-E2F1-FLAG質(zhì)粒構(gòu)建成功。GST Pull-down實(shí)驗(yàn)表明，在體外條件下，E2F1蛋白與Sedlin蛋白存在相互作用。在熒光顯微鏡下觀察到，E2F1蛋白主要分布在COS-7細(xì)胞核內(nèi)，而Sedlin蛋白除了細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有分布；共定位實(shí)驗(yàn)觀察E2F1蛋白與Sedlin蛋白在核內(nèi)存在部分共定位。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，在H