肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(LCMR1)相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、目的：肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（lung cancer metastasis related protein1，LCMR1）的編碼基因是我們實驗室采用差異顯示技術(shù)克隆到的新基因（GenBank ID：AY148462），目前其生物學(xué)功能不明確。本實驗擬通過蛋白-蛋白相互作用研究，尋找與LCMR1相互作用的蛋白，為進一步研究LCMR1基因的功能及其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供線索和分子基礎(chǔ)。
　　 方法：（1）將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-L

2、CMR1轉(zhuǎn)化入酵母菌，檢測誘餌質(zhì)粒有無轉(zhuǎn)錄激活活性和宿主毒性，鑒定BD-LCMR1融合蛋白的表達情況。（2）以95D細胞總RNA為模板，采用SMART技術(shù)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，使用長距離PCR擴增ds cDNA片段.（3）將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1、95D細胞cDNA文庫片段及線性化質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基初步篩選陽性克隆。（4）通過反復(fù)劃線培養(yǎng)及重復(fù)檢測報告基因激活等方

3、法，去除假陽性克隆。（5）提取陽性克隆質(zhì)粒，分離并擴增單個文庫質(zhì)粒。將pGBKT7-LCMR1誘餌質(zhì)粒和單個文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，驗證其相互作用。（6）回復(fù)驗證為陽性的質(zhì)粒測序并進行生物信息學(xué)分析.（7）應(yīng)用免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)在細胞內(nèi)對酵母雙雜交結(jié)果進行驗證，確認(rèn)蛋白質(zhì)相互作用。（8）應(yīng)用融合蛋白沉降（GST pull-down）技術(shù)在體外對其結(jié)果進一步驗證，確定蛋白質(zhì)相互作用.
　　 結(jié)果：（1）誘餌質(zhì)粒p

4、GBKT7-LCMR1測序鑒定正確，經(jīng)檢測誘餌質(zhì)粒無自激活作用和宿主毒性，Western blot實驗證實誘餌質(zhì)?？稍诮湍钢姓_表達融合蛋白BD-LCMR1。（2）以95D細胞總RNA為模板合成ds cDNA，產(chǎn)物純化后經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察到一條明亮的彌散狀條帶，大小在250
　　 bp-6000bp，符合文庫構(gòu)建要求。（3）應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)初步篩選到6種蛋白與LCMR1存在相互作用，選取其中3種蛋白（RPL29

5、、GNG5、DEK）進行后續(xù)驗證與研究。（4）應(yīng)用免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)及融合蛋白沉降（GSTpull-down）技術(shù)在細胞內(nèi)和在體外對酵母雙雜交結(jié)果進行驗證，確定RPL29與LCMR1有相互作用，DEK與LCMR1有相互作用，GNG5與LCMR1無相互作用。
　　 結(jié)論：（1）重組質(zhì)粒pGBKT7-LCMR1無自激活作用和宿主毒性，能夠在酵母細胞中正確表達，可作為酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌質(zhì)粒。（2）成功構(gòu)建95D細胞cDNA