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文檔簡介
1、目的:肺癌轉移相關蛋白1(lung cancer metastasis related protein1,LCMR1)的編碼基因是我們實驗室采用差異顯示技術克隆到的新基因(GenBank ID:AY148462),目前其生物學功能不明確。本實驗擬通過蛋白-蛋白相互作用研究,尋找與LCMR1相互作用的蛋白,為進一步研究LCMR1基因的功能及其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供線索和分子基礎。
方法:(1)將誘餌質粒pGBKT7-L
2、CMR1轉化入酵母菌,檢測誘餌質粒有無轉錄激活活性和宿主毒性,鑒定BD-LCMR1融合蛋白的表達情況。(2)以95D細胞總RNA為模板,采用SMART技術在逆轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈,使用長距離PCR擴增ds cDNA片段.(3)將誘餌質粒pGBKT7-LCMR1、95D細胞cDNA文庫片段及線性化質粒pGADT7-Rec共轉化酵母菌AH109,用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基初步篩選陽性克隆。(4)通過反復劃線培養(yǎng)及重復檢測報告基因激活等方
3、法,去除假陽性克隆。(5)提取陽性克隆質粒,分離并擴增單個文庫質粒。將pGBKT7-LCMR1誘餌質粒和單個文庫質粒共轉化酵母菌AH109,驗證其相互作用。(6)回復驗證為陽性的質粒測序并進行生物信息學分析.(7)應用免疫共沉淀(CO-IP)技術在細胞內對酵母雙雜交結果進行驗證,確認蛋白質相互作用。(8)應用融合蛋白沉降(GST pull-down)技術在體外對其結果進一步驗證,確定蛋白質相互作用.
結果:(1)誘餌質粒p
4、GBKT7-LCMR1測序鑒定正確,經(jīng)檢測誘餌質粒無自激活作用和宿主毒性,Western blot實驗證實誘餌質粒可在酵母中正確表達融合蛋白BD-LCMR1。(2)以95D細胞總RNA為模板合成ds cDNA,產(chǎn)物純化后經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,觀察到一條明亮的彌散狀條帶,大小在250
bp-6000bp,符合文庫構建要求。(3)應用酵母雙雜交技術初步篩選到6種蛋白與LCMR1存在相互作用,選取其中3種蛋白(RPL29
5、、GNG5、DEK)進行后續(xù)驗證與研究。(4)應用免疫共沉淀(CO-IP)技術及融合蛋白沉降(GSTpull-down)技術在細胞內和在體外對酵母雙雜交結果進行驗證,確定RPL29與LCMR1有相互作用,DEK與LCMR1有相互作用,GNG5與LCMR1無相互作用。
結論:(1)重組質粒pGBKT7-LCMR1無自激活作用和宿主毒性,能夠在酵母細胞中正確表達,可作為酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌質粒。(2)成功構建95D細胞cDNA
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