肺癌轉移相關蛋白1(LCMR1)相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、目的：肺癌轉移相關蛋白1（lung cancer metastasis related protein1，LCMR1）的編碼基因是我們實驗室采用差異顯示技術克隆到的新基因（GenBank ID：AY148462），目前其生物學功能不明確。本實驗擬通過蛋白-蛋白相互作用研究，尋找與LCMR1相互作用的蛋白，為進一步研究LCMR1基因的功能及其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供線索和分子基礎。
　　 方法：（1）將誘餌質粒pGBKT7-L

2、CMR1轉化入酵母菌，檢測誘餌質粒有無轉錄激活活性和宿主毒性，鑒定BD-LCMR1融合蛋白的表達情況。（2）以95D細胞總RNA為模板，采用SMART技術在逆轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，使用長距離PCR擴增ds cDNA片段.（3）將誘餌質粒pGBKT7-LCMR1、95D細胞cDNA文庫片段及線性化質粒pGADT7-Rec共轉化酵母菌AH109，用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基初步篩選陽性克隆。（4）通過反復劃線培養(yǎng)及重復檢測報告基因激活等方

3、法，去除假陽性克隆。（5）提取陽性克隆質粒，分離并擴增單個文庫質粒。將pGBKT7-LCMR1誘餌質粒和單個文庫質粒共轉化酵母菌AH109，驗證其相互作用。（6）回復驗證為陽性的質粒測序并進行生物信息學分析.（7）應用免疫共沉淀（CO-IP）技術在細胞內對酵母雙雜交結果進行驗證，確認蛋白質相互作用。（8）應用融合蛋白沉降（GST pull-down）技術在體外對其結果進一步驗證，確定蛋白質相互作用.
　　 結果：（1）誘餌質粒p

4、GBKT7-LCMR1測序鑒定正確，經(jīng)檢測誘餌質粒無自激活作用和宿主毒性，Western blot實驗證實誘餌質粒可在酵母中正確表達融合蛋白BD-LCMR1。（2）以95D細胞總RNA為模板合成ds cDNA，產(chǎn)物純化后經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察到一條明亮的彌散狀條帶，大小在250
　　 bp-6000bp，符合文庫構建要求。（3）應用酵母雙雜交技術初步篩選到6種蛋白與LCMR1存在相互作用，選取其中3種蛋白（RPL29

5、、GNG5、DEK）進行后續(xù)驗證與研究。（4）應用免疫共沉淀（CO-IP）技術及融合蛋白沉降（GSTpull-down）技術在細胞內和在體外對酵母雙雜交結果進行驗證，確定RPL29與LCMR1有相互作用，DEK與LCMR1有相互作用，GNG5與LCMR1無相互作用。
　　 結論：（1）重組質粒pGBKT7-LCMR1無自激活作用和宿主毒性，能夠在酵母細胞中正確表達，可作為酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌質粒。（2）成功構建95D細胞cDNA