ZHC116的抗炎作用研究.pdf

1、第一章:MTT法檢測ZHC116對NIH3T3細胞增殖的影響
　　研究背景:纖維化是指纖維結(jié)締組織在細胞外大量沉積的過程，可累及多個臟器，嚴(yán)重危害人類健康，目前臨床上尚缺乏特效藥物治療。吡啶酮類化合物是新型廣譜抗炎、抗纖維化的藥物，其代表藥物吡非尼酮(Pirfenidone，5-甲基1-苯基2-(1H)吡啶酮），在日本及歐洲已批準(zhǔn)用于治療特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）。氟非尼酮

2、(fluorofenidone，AKF-PD)是本課題組獨立研發(fā)的吡非尼酮的me-better藥物，已申請一期臨床研究。ZHC116是本課題組新近合成并篩選出來的另一吡啶酮類化合物，較AKF-PD及吡非尼酮，具有效果更強、副作用小、治療窗廣等特點。前期研究證實，ZHC116具有較強的抗纖維化效應(yīng)。纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜，其中成纖維細胞增殖起重要作用。成纖維細胞是產(chǎn)膠原細胞（即肌成纖維細胞）的主要來源，經(jīng)活化后可分泌大量一、三型膠原和纖連蛋

3、白，從而導(dǎo)致器官纖維化的發(fā)生。MTT比色法，是一種常用的檢測細胞增殖的方法，具有簡便、快速、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，在國內(nèi)外已被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細胞毒性檢測等領(lǐng)域。MTT檢測藥物對NIH3T3細胞（小鼠胚胎成纖維細胞）增殖的影響可部分反映藥物的抗纖維化效能。
　　目的:檢測ZHC116對NIH3T3細胞增殖的影響，探索藥物作用的有效濃度范圍。
　　方法:以NIH3T3細胞株為研究對象，加入濃度梯度的藥物ZHC116(0.05mM

4、、0.1mM、0.15mM、0.20mM)，分別孵育48或72小時，MTT法比較各組吸光度值，計算半效抑制濃度(IC50)。
　　結(jié)果:0.05mM的ZHC116對NIH3T3細胞無明顯抑制作用，在0.10-0.20mM的濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增高及作用時間的延長，ZHC116對NIH3T3細胞的抑制率逐漸增高。
　　結(jié)論:在0.10-0.20mM濃度范圍內(nèi)，ZHC116對NIH3T3細胞的增殖具有抑制作用。
　　第二章

5、:ZHC116對內(nèi)毒素血癥小鼠死亡率及炎癥因子IL-1β的影響
　　研究背景:本課題組前期研究證實，ZHC116可以減輕腎纖維化模型早期巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，減輕腎間質(zhì)損傷，提示潛在的抗炎作用，而其對全身炎癥反應(yīng)的作用不明。內(nèi)毒素血癥是全身炎癥反應(yīng)綜合征的經(jīng)典模型。在脂多糖(LPS)刺激下，大量炎癥介質(zhì)基因過度表達，從而導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)和免疫紊亂。NALP3炎性體是由凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)、caspase蛋白酶以及

6、NOD樣受體(NLRP3)組成的復(fù)合體，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。其能激活caspase-1，活化的caspase-1切割前體IL-1β為成熟體。NALP3、ASC、caspase-1基因敲除對內(nèi)毒素小鼠具有保護作用。IL-1β是經(jīng)典的早期炎癥因子，亦可作為炎性體活化的標(biāo)志。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，AKF-PD能有效改善內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率，并降低IL-1β的水平。而ZHC116在此方面的作用尚待研究。
　　目的:觀察ZHC116

7、對內(nèi)毒素血癥模型小鼠死亡率及炎癥因子IL-1β的影響。
　　方法:取64只Balb/c小鼠隨機分為以下四組:對照組、LPS模型組、ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD(200mg/kg)治療組。LPS模型組及藥物處理組予以LPS(15mg/kg)腹腔注射，同時腹腔內(nèi)給予藥物或等體積的PBS，記錄各組小鼠第0-144小時存活只數(shù)。另取40只Balb/c小鼠，按同樣方式分組，每組10只，藥物（或PBS）與LPS同時腹腔注射，2

8、小時后取血，ELISA檢測炎癥因子IL-1β。
　　結(jié)果:144小時內(nèi)，對照組無小鼠死亡，LPS組死亡率明顯升高，達87.5％（死亡數(shù)/總數(shù)=14/16）;腹腔注射ZHC116（50mg/kg）及AKF-PD(200mg/kg)均能顯著降低內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率，分別為43.75％(7/16，ZHC116組)和31.25％（5/16，AKF-PD組），兩組較LPS組，均有統(tǒng)計學(xué)差異。兩藥物治療組之間無明顯差異。LPS腹腔注射2小時

9、后，小鼠血清中IL-1β的濃度明顯增高，ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD(200mg/kg)治療后明顯下降，兩治療組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:ZHC116對內(nèi)毒素血癥小鼠具有保護作用，并能降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清中IL-1β的水平。ZHC116(50mg/kg)與AKF-PD(200mg/kg)作用相當(dāng)。
　　第三章:ZHC116對腹腔巨噬細胞表達IL-1β及對NALP3炎性體的影響
　　研究背景:腹腔巨

10、噬細胞是內(nèi)毒素血癥的的主要作用細胞。LPS刺激后，腹腔巨噬細胞一方面負責(zé)清除細菌病原體及壞死的組織、細胞等。另一方面分泌大量的炎性因子介質(zhì)(如IL-1β)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。炎性體主要存在于巨噬細胞中，在內(nèi)毒素血癥中介導(dǎo)免疫細胞的死亡和機體的免疫抑制。
　　前一部分的研究發(fā)現(xiàn)，ZHC116能降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清中IL-1β的水平，但具體作用于IL-1β的合成水平還是通過作用于炎性體影響IL-1β的成熟尚不清楚。
　　目的:探討

11、ZHC116對LPS誘導(dǎo)腹腔原代巨噬細胞表達和釋放IL-1β及對炎性體組分NALP3及caspase-1表達的影響
　　方法:獲取小鼠腹腔原代巨噬細胞，分為四組:對照組、LPS刺激組及ZHC116(0.1mM)治療組。予ZHC116(0.1mM)處理24小時后，予以LPS（1μg/ml）刺激細胞，24小時后收集細胞上清及提取細胞總RNA及總蛋白。以ELISA法檢測細胞外IL-1β的水平，同時行熒光定量PCR、western blo

12、t檢測前體IL-1β的水平，并行熒光定量PCR檢測ZHC116對NALP3炎性體的主要組分NALP3、caspase-1 mRNA表達的影響。
　　結(jié)果:LPS（1μg/ml）刺激24小時后，上清的IL-1β水平明顯增高，給予ZHC116(0.1mM)處理后，IL-1β水平明顯降低。熒光定量PCR及前體IL-1β的western結(jié)果顯示，ZHC116(0.1mM)能顯著抑制IL-1β的轉(zhuǎn)錄。NALP3及caspase-1的熒光定量