基于ROCK通路探討加味五苓散對DBD模型大鼠的預(yù)防作用及其機(jī)制.pdf

1、目的:
　　本研究在前期文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，提出用加味五苓散預(yù)防性干預(yù)STZ誘導(dǎo)下糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠，從動物行為學(xué)、尿動力學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等多角度評價中藥預(yù)防性干預(yù)糖尿病神經(jīng)源性膀胱的效應(yīng)，并借助ROCK信號通道，探討加味五苓散作用糖尿病神經(jīng)源性膀胱的可能分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.動物分組與造模:
　　將70只體重約為180-220gSD大鼠隨機(jī)分為5組，即空白組10只，模型組、加味五苓散高劑量組、加味五

2、苓散中劑量組、加味五苓散低劑量組各15只。各組大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，糖尿病模型各組大鼠開始進(jìn)入高脂高糖飼料喂養(yǎng)階段，4周高脂飼料喂養(yǎng)后糖尿病模型各組大鼠予腹腔注射STZ進(jìn)行糖尿病造模，造模成功后，繼續(xù)喂養(yǎng)8周，直至糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠模型自然形成。
　　2.干預(yù)措施
　　加味五苓散高、中、低劑量組經(jīng)體表面積換算分別每日灌胃加味五苓散水煎液6ml、3ml、1.5ml，余下兩組予每日灌服3ml生理鹽水，連續(xù)灌胃8周。

3、　　3.觀測指標(biāo)
　?、儆^察各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，定期檢測體重、血糖、代謝指標(biāo)等。第13周時，各組大鼠均進(jìn)行尿動力檢測，結(jié)合體重、血糖、代謝指標(biāo)和尿動力學(xué)等作為判斷糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠造模成功以否的重要指標(biāo)。②尿動力學(xué)檢測后取材。將4％多聚甲醛固定過的膀胱組織進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯透明，蠟缸浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋，用鋒利刀片將組織蠟塊切成約3-4μ m的切片，進(jìn)行HE染色，結(jié)合HE染色和尿動力學(xué)結(jié)果對于加味五苓散對糖尿病神經(jīng)源性膀胱

4、模型大鼠膀胱組織效果進(jìn)行評價。③進(jìn)行免疫組化、Western Blot和RT-PCR檢測，結(jié)合三種檢測手段對于加味五苓散對于糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠膀胱組織ROCK通道各蛋白表達(dá)影響進(jìn)行評估。
　　4.統(tǒng)計分析
　　采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較方差齊時采用方差分析;方差不齊時，數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差齊，仍采用方差分析，經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊時，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。多個不同時點(diǎn)數(shù)據(jù)

5、比較采用重復(fù)測量方差分析，對不滿足協(xié)方差矩陣或球形檢驗(yàn)采用矯正檢驗(yàn)(Greenhouse-Geisser)方法及兩兩比較，或者采用多元方差分析，檢驗(yàn)水平α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.文獻(xiàn)研究
　?、偬悄虿∩窠?jīng)源性膀胱現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展
　　目前學(xué)界對于糖尿病神經(jīng)源性膀胱的發(fā)病機(jī)制莫衷一是，比較公認(rèn)的是認(rèn)為糖尿病膀胱障礙的出現(xiàn)主要與長期高糖狀態(tài)下導(dǎo)致膀胱組織粘膜、肌層、血管或神經(jīng)等處病變相關(guān)，近幾年糖尿病神經(jīng)源

6、性膀胱研究的主要突破在于該病病理生理上時間依賴性的發(fā)現(xiàn)，目前針對糖尿病神經(jīng)源性膀胱發(fā)病機(jī)制研究主要集中在膽堿能受體、內(nèi)皮源性NO、氧化應(yīng)激作用、神經(jīng)生長因子等。目前糖尿病神經(jīng)源性膀胱的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療且以對癥治療為主，未有特效藥物問世，療效尚有待評估。
　　②糖尿病神經(jīng)源性膀胱中醫(yī)認(rèn)識
　　通過古代文獻(xiàn)學(xué)習(xí)得知，糖尿病神經(jīng)源性膀胱可由多種內(nèi)外因共同引起，但糖尿病神經(jīng)源性膀胱的關(guān)鍵病機(jī)在于腎陽虛所致膀胱氣化不利，因而治療當(dāng)與溫陽化

7、氣行水為綱。現(xiàn)代醫(yī)家廣泛運(yùn)用中藥、針灸等中醫(yī)內(nèi)外治法治療糖尿病神經(jīng)源性膀胱，但本研究經(jīng)過對于現(xiàn)有中醫(yī)治療糖尿病神經(jīng)源性膀胱的文獻(xiàn)得知，無論從治療有效率還是膀胱殘余尿量來看，中醫(yī)對糖尿病神經(jīng)源性膀胱有確切的療效。但分析文獻(xiàn)可見現(xiàn)有文獻(xiàn)證據(jù)質(zhì)量較低，存在各種偏倚的可能性。而中醫(yī)藥防治糖尿病神經(jīng)源性膀胱實(shí)驗(yàn)研究非常匱乏，且現(xiàn)有研究的研究質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。
　?、畚遘呱⒀芯楷F(xiàn)狀
　　五苓散作為仲景千古治水名方，在臨床上得到醫(yī)家廣泛

8、應(yīng)用，目前研究顯示五苓散可治療內(nèi)外婦兒各科超過100多種疾病，且五苓散在糖尿病及糖尿病神經(jīng)源性膀胱的治療中也有確切的療效，筆者通過分析文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)五苓散功不僅僅在于利水，而對人體水液代謝具有潛在雙向調(diào)節(jié)作用。
　　④ROCK通道糖尿病相關(guān)性研究
　　多項研究表明ROCK信號通路與糖尿病大血管并發(fā)癥和糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)，已成為包括糖尿病神經(jīng)源性膀胱在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥防治研究的潛在突破口。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究

9、
　?、俳M間基線
　　第0周時即實(shí)驗(yàn)開始前，各組大鼠體重經(jīng)統(tǒng)計無顯著性差異(P＞0.05)，說明實(shí)驗(yàn)各組分組均勻，組間基線一致，本次實(shí)驗(yàn)大鼠各組具有可比性。
　?、谔悄虿∩窠?jīng)源性膀胱造模
　　從體重來看，模型組大鼠體重較空白組大鼠低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從血糖來看，經(jīng)STZ腹腔注射后，模型組大鼠血糖顯著性上升，均值大于16.9 mmol·L-1，與空白組大鼠相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

10、提示本次實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制糖尿病大鼠模型。從代謝指標(biāo)來看，模型組大鼠的食量、尿量和飲水量均較空白組大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），可以看出模型組大鼠已出現(xiàn)糖尿病典型的“三多”癥狀。尿動力學(xué)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組呈現(xiàn)排尿時間延長，順應(yīng)性增高等特點(diǎn)，兩者相比，具有顯著性差異（P＜0.01）。尿動力學(xué)結(jié)果提示模型組大鼠逼尿肌功能已經(jīng)受損。HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠膀胱組織出現(xiàn)膀胱壁增厚、肌纖維排列紊亂，肌細(xì)胞形態(tài)各異，肌束間隙增寬等

11、糖尿病大鼠神經(jīng)源膀胱典型病理改變，綜合以上結(jié)果可認(rèn)為本次實(shí)驗(yàn)已成功用STZ注射誘導(dǎo)糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠模型。
　?、奂游段遘呱㈩A(yù)防性干預(yù)糖尿病神經(jīng)源性膀胱效應(yīng)
　　從血糖來看，中藥各組經(jīng)糖尿病造模后血糖上升，與空白組大鼠相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但與模型組相比無差異（P＞0.05）。因此可以認(rèn)為加味五苓散對實(shí)驗(yàn)大鼠血糖并沒有產(chǎn)生影響。從代謝指標(biāo)來看，僅中劑量組食量、尿量和飲水量指標(biāo)較模型組有改善趨勢，但并沒

12、有顯著性差異（P＞0.05）。尿動力學(xué)方面，在中藥各組和模型組相比，中劑量組大鼠在排尿時間和順應(yīng)性等指標(biāo)上優(yōu)于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量組和低劑量組和模型組相比，在排尿時間和順應(yīng)性等方面有減少的趨勢，但差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？烧J(rèn)為加味五苓散有改善實(shí)驗(yàn)大鼠尿動力指標(biāo)的作用，但不存在劑量依賴性。HE染色結(jié)果來看，中藥干預(yù)各組可見部分肌纖維排列較亂，但較模型組相比，肌纖維排列，肌束間隙等病理狀態(tài)均有所改

13、善。鏡下結(jié)果表明加味五苓散預(yù)防性干預(yù)對糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠膀胱組織有一定保護(hù)和修復(fù)作用。
　?、芗游段遘呱τ赗OCK通道影響
　　免疫組化結(jié)果顯示，ROCK1和ROCK2蛋白在正常組大鼠膀胱組織肌肉細(xì)胞漿中表達(dá)，鏡下表現(xiàn)為胞漿部分染色呈棕黃色，這和文獻(xiàn)所記載和抗體說明書基本相符，其中模型組大鼠表達(dá)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿棕黃色部分明顯加深，部分呈深棕色，而中藥各組表達(dá)均較模型組弱，鏡下圖像表現(xiàn)為細(xì)胞漿棕黃色部分較模型組明顯

14、較淺?？梢钥闯黾游段遘呱⒏鹘M在ROCK通道表達(dá)上較模型組有所改善，中藥各組之間并不存在明顯差異。
　　Western Blot結(jié)果顯示中藥各組有下調(diào)表達(dá)ROCK1和ROCK2蛋白的趨勢，其中中劑量組可顯著下調(diào)ROCK1的表達(dá)(P＜0.05)。
　　RT-PCR結(jié)果顯示中藥高劑量和中劑量組均有抑制ROCK1mRNA和ROCK2mRNA表達(dá)的作用，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。并顯示出下調(diào)MLCKmRNA的趨勢

15、。
　　結(jié)論:
　　1，由于發(fā)病機(jī)制尚未明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于糖尿病神經(jīng)源性膀胱治療尚無特效的對因治療，現(xiàn)有治療方案療效欠佳，中醫(yī)藥在糖尿病神經(jīng)源性膀胱防治中有著獨(dú)特優(yōu)勢，文獻(xiàn)分析顯示中醫(yī)藥治療糖尿病神經(jīng)源性膀胱有確切的療效，中醫(yī)藥研究亟需大規(guī)模隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)和針對作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究以提供更高質(zhì)量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。五苓散作為千古治水名方，對人體水液代謝具有潛在的雙向調(diào)節(jié)作用，高度契合糖尿病神經(jīng)源性膀胱的生理病理，對于該病的治療具有