兩個先天性白內(nèi)障家系的致病基因篩查與功能研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究的目的是篩查兩個不同表型的雙側先天性遺傳性白內(nèi)障中國家系的致病基因，并且仔細分析突變的分子和細胞機制。
　　研究方法:
　　兩個家系所有的家庭成員經(jīng)過完整的眼科和其他系統(tǒng)的臨床檢查，記錄詳細的家族史和臨床數(shù)據(jù)，獲得所有家庭成員的知情同意后，收集患者和正常人的血樣，基因組DNA從外周血白細胞中提取，家系1選擇先天性白內(nèi)障高致病基因為候選基因，設計特異性的引物（包含外顯子和兩側的內(nèi)含子區(qū)域），進行PC

2、R擴增，直接測序篩查突變。利用DNA體外重組技術，構建CX50野生型基因表達載體，然后利用定點突變技術，完成CX50突變基因表達載體的構建，轉(zhuǎn)染293細胞，通過共聚焦顯微鏡評估重組蛋白的表達和分布。家系2選取白內(nèi)障相關的多態(tài)性微衛(wèi)星遺傳標記，設計并合成引物，利用梯度聚合酶鏈反應擴增DNA片斷，8％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 DNA片斷，依據(jù)電泳結果進行基因分型，利用等位基因共享分析及測序?qū)蜻x基因進行排除性定位。
　　研究結果：

3、>　　根據(jù)候選基因編碼區(qū)測序結果顯示家系1的GJA8基因的94位堿基有一個雜合的顛換，導致了CX50編碼序列高度保守的32位氨基酸由苯丙氨酸替換為異亮氨酸。這個新的突變出現(xiàn)在常染色體顯性先天性全白內(nèi)障的家系中所有的病人中，其他正常的家庭成員中沒有發(fā)生突變。當表達在293細胞中時，CX50與GFP形成融合蛋白，通過共聚焦顯微鏡觀察到的結果顯示：無論是野生型的還是突變體都有間隙連接斑塊的形成，并且兩者沒有量的差別，在細胞膜和細胞質(zhì)中都能觀察

4、到點狀的分布。家系2中GJA3基因的130位堿基有一雜合的轉(zhuǎn)換導致了蛋氨酸對纈氨酸的取代，從而破壞了蛋白質(zhì)的功能。
　　研究結論:
　　家系1中在GJA8的第一細胞外基質(zhì)結構域發(fā)現(xiàn)了一個新的突變，我們的發(fā)現(xiàn)更近一步擴大了常染色體顯性先天性全白內(nèi)障相關的突變譜。本研究家系1鑒定的突變的氨基酸的替換位于第一跨膜區(qū)，細胞連接斑塊的數(shù)量和亞細胞定位沒有改變，研究的結果提示這個突變通過其他的致病機制導致白內(nèi)障的形成。家系2的研究結果確