BRAF基因突變與惡性腫瘤的系統(tǒng)評價及其痕量檢測方法的構(gòu)建.pdf

1、腫瘤是威脅公眾生命健康的重大疾病,在發(fā)達國家和發(fā)展中國家造成的死亡率分別位于首位和第二位。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2014年美國預(yù)計將有167萬新生腫瘤患者,死亡人數(shù)將達到58萬之多,位于前三位的分別是肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌(女性為乳腺癌)。腫瘤形勢如此嚴峻,不僅給世界各國的經(jīng)濟社會帶來沉重的負擔,而且給腫瘤全球防控帶來嚴重的挑戰(zhàn)。如何有效地控制腫瘤的患病率與死亡率已經(jīng)成為衛(wèi)生決策者、臨床醫(yī)生及相關(guān)研究者亟待解決的重大問題。
　　研究

2、發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診治及預(yù)后與腫瘤基因位點的改變有著密切的關(guān)系, KRAS基因突變就是上述眾多基因位點改變中的一種。目前,臨床研究已經(jīng)證明KRAS基因突變與單克隆抗體藥物治療腫瘤失敗有著密切的關(guān)系,美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)已經(jīng)推薦將其作為單抗藥物治療腫瘤之前必做的一項檢查。然而,少部分KRAS野生型的患者仍然會出現(xiàn)上述情況,究其原因主要是KRAS基因下游的核心分子 B

3、RAF基因突變促使絲裂原活化蛋白激酶( Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)途徑持續(xù)性激活導致的。
　　目前,研究者已經(jīng)在多種腫瘤中檢測到了BRAF基因突變,而且對其結(jié)構(gòu)及相關(guān)性質(zhì)進行了深入的研究,取得了突破性的進展。與此同時,關(guān)于BRAF基因突變與臨床常見惡性腫瘤病理特征之間關(guān)系的臨床研究報道也越來越多,然而得到的結(jié)論差異性很大,存在的爭議性問題較多。
　　盡管如此,臨床實踐中仍然采

4、用了一些方法對BRAF基因突變進行檢測分析,以期為臨床腫瘤患者的藥物治療提供一些參考。然而,目前的檢測方法靈敏度普遍較低,檢測BRAF基因痕量突變能力不足。高分辨率熔解曲線(high resolution melting curve, HRMA)是臨床上靈敏度相對較高的一種方法,其靈敏度可以達到5％左右。目前,關(guān)于 HRMA檢測 BRAF基因突變的臨床研究報道逐年增多,但是研究中收集檢測的樣本量卻均較小,檢測的準確性難以評估,缺乏統(tǒng)計學

5、說服力,而且尚未有研究通過統(tǒng)計學方法對其準確性進行過系統(tǒng)性地評價與分析。因此,HRMA能否用于臨床BRAF基因痕量突變的檢測分析還需要進一步的研究與探討。
　　近年來,分子生物學技術(shù)取得了突飛猛進的發(fā)展,針對BRAF基因突變檢測的新技術(shù)也相繼被研發(fā)出來。鎖式PCR是上述新技術(shù)中檢測低豐度突變更為有效的方法之一,其主要是使用了鎖核酸探針用于提高堿基錯配識別的能力,使檢測的靈敏度更高,更適合痕量基因突變的檢測分析。然而,目前這種方法仍

6、然存在諸多問題,如:需要特異性的DNA聚合酶、對擴增的DNA質(zhì)量要求高、突變鑒別采用凝膠電泳費時費力等,這些問題仍然需要進一步完善與改進。
　　鑒于此,本課題擬首先采用可以解決研究結(jié)果不一致與增加統(tǒng)計學功效的系統(tǒng)評價與 Meta分析的方法對 BRAF基因突變與常見惡性腫瘤病理特征之間關(guān)系存在的爭議問題進行解決,進一步明確檢測BRAF基因突變的重要意義。在此基礎(chǔ)上,對目前臨床靈敏度較高的 HRMA檢測分析 BRAF基因突變的準確性進

7、行系統(tǒng)性地評估,了解是否有必要構(gòu)建一種新的靈敏度更高的方法。如果目前HRMA靈敏度確實無法滿足臨床的需要,本研究則在鎖式PCR的基礎(chǔ)上進行改進與完善,構(gòu)建一種基于LNA/DNA探針的高靈敏度方法用于結(jié)直腸腫瘤中BRAFV600E基因痕量突變的檢測分析。
　　目的:
　　1、通過對BRAF基因突變與常見惡性腫瘤(結(jié)直腸腫瘤、肺癌)病理特征之間關(guān)系的系統(tǒng)評價及Meta分析,進一步明確檢測BRAF基因突變的臨床意義。
　　2

8、、通過對HRMA檢測BRAF基因突變準確性的系統(tǒng)評價及Meta分析,了解構(gòu)建高靈敏度BRAF基因痕量突變檢測新方法的必要性。
　　3、通過對鎖式PCR方法的改進與完善,構(gòu)建一種用于結(jié)直腸腫瘤BRAF基因痕量突變檢測的高靈敏度方法,并用于臨床標本進行驗證分析。
　　方法:
　　1、通過檢索PubMed、EmBase、SCI(科學引文索引)三大數(shù)據(jù)庫,收集關(guān)于BRAF基因突變與常見惡性腫瘤病理特征關(guān)系及 HRMA檢測 BR

9、AF基因突變的相關(guān)文獻資料;按照制定的納入標準對文獻資料進行篩選與納入;然后對納入文獻資料進行質(zhì)量評價、數(shù)據(jù)提取與合并及其他一些相關(guān)分析。
　　2、設(shè)計與合成引物對及LNA/DNA嵌合體探針;對最佳引物對及其濃度、探針濃度、熒光染料濃度、退火溫度等條件進行優(yōu)化,確定BRAFV600E基因痕量突變檢測的最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。
　　3、評價新構(gòu)建方法的靈敏度、特異性、重復性及準確性等指標,并用50例臨床標本進行驗證分析,評估其

10、檢測臨床標本的能力。
　　結(jié)果:
　　1、BRAFV600E基因突變與結(jié)直腸腫瘤病理特征之間關(guān)系的系統(tǒng)評價納入了25篇文獻資料,涉及的病例數(shù)達到11955例,BRAFV600E基因突變率約為10.8%。研究結(jié)果表明,BRAFV600E基因突變與結(jié)直腸腫瘤患者的多項特征具有顯著相關(guān)性:性別(OR=1.71;95% CI=1.42-2.07)、年齡(OR=2.29;95% CI=1.13-4.61)、TNM分期(OR=1.59;

11、95% CI=1.16-2.17)、分化情況(OR=3.89;95% CI=2.94-5.17)、病理類型(OR=2.99;95% CI=2.20-4.07)、腫瘤位置(OR=4.85;95% CI=3.59-6.56)、MSI狀態(tài)(OR=8.18;95% CI=5.08-13.17)、CIMP狀態(tài)(OR=16.44;95% CI=6.72-40.21)、MLH1狀態(tài)(OR=13.84;95% CI=1.75-109.24)。
　

12、　2、BRAF基因突變與肺癌病理特征之間關(guān)系的系統(tǒng)評價納入了10篇文獻資料,涉及的病例數(shù)達到5599例,BRAF基因突變率約為3.0%。研究結(jié)果表明,BRAF基因突變與肺癌病理類型具有顯著相關(guān)性(OR=4.96;95%CI=2.29-10.75)。BRAFV600E基因突變與肺癌患者的兩項特征具有顯著相關(guān)性:性別(OR=0.27;95%CI=0.12-0.59)、吸煙(OR=0.14;95%CI=0.05-0.42)。
　　3、H

13、RMA檢測BRAF基因突變準確性的系統(tǒng)評價納入14篇文獻資料,涉及的檢測樣本達到1324例。研究結(jié)果表明,敏感性為0.99(95%CI=0.96-1.00)、特異性為0.99(95%CI=0.99-1.00)、陽性似然比為68.01(95%CI=25.33-182.64)、陰性似然比為0.06(95%CI=0.03-0.11)、診斷比值比為1263.76(95%CI=393.91-4064.39)、SROC曲線的曲線下面積為0.995。

14、
　　4、完成了相關(guān)引物對及LNA/DNA嵌合體探針的設(shè)計與合成,確定了檢測BRAFV600E基因突變的最佳反應(yīng)體系:引物對為HQ-458/461,其濃度為0.2μM;退火溫度為60℃;探針HQ-356濃度為0.5μM;EvaGreen染料為2× EvaGreen,循環(huán)數(shù)為50 cycles。
　　5、靈敏度檢測結(jié)果顯示可以達到0.01%,50臨床樣本的檢測結(jié)果顯示陽性率為16%(8/50),明顯高于傳統(tǒng)PCR聯(lián)合測序的方法

15、(10%,5/50)。
　　結(jié)論:
　　1、結(jié)直腸腫瘤患者中BRAFV600E基因突變與性別、年齡、分期、分化、病理類型、位置、MSI、CIMP及 MLH1等臨床病理及分子病理特征之間具有顯著的相關(guān)性。結(jié)果提示BRAFV600E與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診治及預(yù)后具有密切的關(guān)系,應(yīng)該將其作為結(jié)直腸腫瘤預(yù)測與預(yù)后的一種標志物,用于結(jié)直腸腫瘤患者個體化藥物治療前的篩查。
　　2、肺癌患者中BRAF基因突變與腺癌具有顯著的相

16、關(guān)性,BRAFV600E與女性及非吸煙者有一定的相關(guān)性。結(jié)果提示肺癌患者個體化用藥前可以將BRAF基因突變與KRAS基因突變聯(lián)合進行篩查,提高腫瘤個體化用藥的準確性,篩查的主要對象是腺癌及女性患者。
　　3、HRMA方法檢測BRAF基因突變的準確性非常高,是目前臨床檢測BRAF突變較為理想的一種方法。但其不足之處是檢測的靈敏度較低,只適合中晚期腫瘤患者標本的檢測分析。
　　4、構(gòu)建的基于LNA/DNA探針的Real-Time