基于內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性片段提高基因痕量突變檢測(cè)方法的構(gòu)建及臨床運(yùn)用.pdf

1、腫瘤是機(jī)體細(xì)胞因失去正常調(diào)控，因過度增殖而形成的新組織，且可侵犯周圍組織或發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤威脅著大眾健康并給社會(huì)家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。有數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)2015年因腫瘤死亡人數(shù)為281萬，即平均每天死亡人數(shù)約7500人，腫瘤防控形勢(shì)在中國(guó)依然嚴(yán)峻。盡早控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，降低其患病率與死亡率已經(jīng)成為相關(guān)研究者急需解決的重大問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤相關(guān)基因位點(diǎn)的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診治及其預(yù)后與有著密切的關(guān)系，其中腫瘤相關(guān)基因位

2、點(diǎn)的改變即基因突變是指基因發(fā)生了堿基對(duì)組成或排列順序的改變。能夠引起腫瘤惡性增生的基因中，KRAS與其下游的核心分子BRAF基因突變是近年來研究的熱點(diǎn)，它們?nèi)魏我粋€(gè)的突變將促使絲裂原活化蛋白激酶途徑持續(xù)性激活，導(dǎo)致組織朝惡性增生的方向發(fā)展。更有臨床研究已經(jīng)證明，由于KRAS基因的突變往往導(dǎo)致臨床常用單克隆抗體藥物治療腫瘤的失效，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)將其推薦為單抗藥物用藥前檢查項(xiàng)目之一。
　　在種類繁多的基因突變檢測(cè)技術(shù)中，鎖

3、式PCR是檢測(cè)基因痕量突變有效的方法之一，其主要原理是使用鎖核酸探針提高堿基錯(cuò)配識(shí)別能力，使檢測(cè)的靈敏度更高，符合基因突變檢測(cè)的要求。然而，這種方法仍然存在諸多問題，如需要特異性的DNA聚合酶、對(duì)擴(kuò)增的DNA質(zhì)量要求高、擴(kuò)增過程中有堿基人工錯(cuò)配導(dǎo)致目的基因非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象等，鑒于此，本課題擬采用內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段的參與來降低檢測(cè)過程中的堿基人工錯(cuò)配，避免目的基因非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象，同時(shí)提高鎖核酸探針對(duì)大量的野生型基因的屏蔽，凸顯出基因

4、痕量突變的突變位點(diǎn)，從而構(gòu)建一種基于內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高野生型抑制性PCR(wirePCR)，對(duì)基因痕量突變特異性擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR達(dá)到基因痕量突變的檢出。
　　目的：
　　1.根據(jù)腫瘤中常見的基因突變位點(diǎn)，結(jié)合內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高鎖核酸抑制野生型背景基因的辦法，構(gòu)建結(jié)直腸腫瘤中KRAS與BRAF基因痕量突變的wirePCR高靈敏度檢測(cè)方法，并對(duì)該方法反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　2.將構(gòu)建的wirePCR檢測(cè)

5、方法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并用優(yōu)化好的反應(yīng)條件對(duì)臨床腸鏡活檢標(biāo)本中KRAS與BRAF基因痕量突變進(jìn)行檢測(cè)并做驗(yàn)證分析。
　　3.進(jìn)一步將內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高野生型抑制性方法運(yùn)用于微滴數(shù)字PCR，用以檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA基因痕量突變。
　　4.構(gòu)建內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與的野生型抑制性多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系，達(dá)到多種基因痕量突變同時(shí)檢測(cè)的目的。
　　方法：
　　1.設(shè)計(jì)合成引物對(duì)及熒光探針，對(duì)引物對(duì)和熒光探針濃度進(jìn)行優(yōu)化、采

6、用溫度梯度PCR對(duì)退火溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化;用已知KRAS和BRAF基因常見突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成LNA/DNA嵌合體探針，以LEPTIN基因作為加入的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與反應(yīng)，構(gòu)建內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高野生型抑制性基因痕量突變熒光定量檢測(cè)體系。并進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)體系的引物、熒光探針、鎖核酸探針等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　2.以突變型的的HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞系和野生型DNA按比例混合作為擴(kuò)增模板，用上述構(gòu)建好的方法及優(yōu)化好的反應(yīng)體系分別對(duì)突

7、變率50％、25％、10％、1％、0.1％、0.01％的模板進(jìn)行wirePCR反應(yīng)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，評(píng)價(jià)內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與的野生型抑制性基因痕量突變檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、及準(zhǔn)確性等指標(biāo)。
　　3.收集腸鏡活檢組織標(biāo)本50例，檢測(cè)DNA濃度并將濃度統(tǒng)一調(diào)整至100ng/ul，按照優(yōu)化的wirePCR反應(yīng)條件分別對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行KRAS和BRAF基因突變檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合20倍鏡下切片HE染色病理分析結(jié)果和直接

8、測(cè)序結(jié)果，對(duì)該方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4.為了適應(yīng)微滴數(shù)字PCR的反應(yīng)條件和操作流程，試驗(yàn)中對(duì)KRAS、BRAF基因的上下游引物進(jìn)行升級(jí)，選用具有更高TM值適應(yīng)數(shù)字PCR的反應(yīng)體系。相應(yīng)地?zé)晒馓结樢沧隽讼鄳?yīng)改進(jìn)，選用帶VIC和FAM熒光基團(tuán)的MGB探針參與反應(yīng)體系，用構(gòu)建的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與的野生型抑制性數(shù)字PCR檢測(cè)標(biāo)本中循環(huán)腫瘤DNA的KRAS、BRAF基因痕量突變情況。
　　5.在內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與的野生型

9、抑制性基因痕量突變檢測(cè)的三重?zé)晒夥磻?yīng)體系中，內(nèi)參LEPTIN基因作為加入的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段，其引物及探針工作濃度與前期實(shí)驗(yàn)一致，KRAS、BRAF基因痕量突變的熒光探針中的熒光基團(tuán)分別采用VIC、HEX、FAM，并兩兩交叉搭配，結(jié)合前期優(yōu)化好的的引物和屏蔽野生型的鎖核酸探針濃度參與反應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.完成了相關(guān)引物對(duì)、熒光探針、及鎖核酸探針(LNA/DNA嵌合體)的設(shè)計(jì)與合成。加入反應(yīng)體系的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段引物對(duì)

10、為HQ-329/330終濃度500nM熒光探針終濃度為100nM。確定了檢測(cè)KRAS基因突變檢測(cè)的最佳反應(yīng)體系：引物對(duì)終濃度為500nM熒光探針終濃度250nM，針對(duì)KRAS基因野生型設(shè)計(jì)嵌合體探針HQ-144，其終濃度為500nM時(shí)能夠?qū)?0-150ng/μL的野生型模板能有效屏蔽;檢測(cè)BRAF基因突變的最佳反應(yīng)體系：引物對(duì)終濃度為500nM熒光探針終濃度250nM，針對(duì)其野生型設(shè)計(jì)嵌合體探針HQ-356，其終濃度為500nM時(shí)能夠?qū)?/p>

11、50-200ng/μL的野生型模板能有效屏蔽，在加入反應(yīng)體系的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段和屏蔽野生型鎖核酸探針作用下，循環(huán)數(shù)60cycles不會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象。
　　2.在評(píng)價(jià)內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與的野生型抑制性基因痕量突變檢測(cè)方法的靈敏度、特異性試驗(yàn)中，運(yùn)用優(yōu)化好的wirePCR反應(yīng)條件，能夠?qū)ν蛔儽壤挥?.01％的DNA模板有效檢出，并有較好重復(fù)性，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.996，擬合滿意，擴(kuò)增效率較高。
　　

12、3.用構(gòu)建好的wirePCR方法對(duì)50例疑似結(jié)直腸癌腸鏡組織進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出18例KRAS基因突變型(36％)和8例BRAF基因突變的標(biāo)本(16％)，本次檢查突變標(biāo)本均為KRAS或BRAF基因單一突變型，沒有同時(shí)突變的現(xiàn)象，檢測(cè)結(jié)果和切片HE染色鏡下病理分析和直接測(cè)序結(jié)果相吻合。
　　4.內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與的野生型抑制性微滴數(shù)字PCR中，體系中的引物終濃度均采用900nM，探針終濃度均采用200nM，模板DNA濃度為50ng

13、/μL。在檢測(cè)KRAS基因痕量突變反應(yīng)體系中，內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性片段擴(kuò)增引物對(duì)采用HQ-329/330，F(xiàn)AM熒光探針選用HQ-1433，KRAS基因引物對(duì)采用HQ-1595/1596，其VIC熒光探針選用HQ-1438，生成總油滴數(shù)1145800個(gè)，KRAS突變基因檢出效率可以達(dá)到0.15％。在檢測(cè)BRAF基因痕量突變反應(yīng)體系中，內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性片段熒光探針選用帶有VIC基團(tuán)的HQ-1434，BRAF基因引物對(duì)采用HQ-1592/1594，熒光探針

14、選用帶有FAM熒光基團(tuán)HQ-671。生成總油滴數(shù)928355個(gè)，BRAF突變基因檢出效率為0.11％。
　　5.內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段參與的野生型抑制性基因痕量突變的三重?zé)晒夥磻?yīng)體系中，加入反應(yīng)體系的內(nèi)參LEPTIN基因和待測(cè)KRAS、BRAF基因引物對(duì)與前期實(shí)驗(yàn)條件一致，為了在相同CT值有相近的熒光強(qiáng)度，三重?zé)晒夥磻?yīng)體系中優(yōu)化好的探針分別為：內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段即內(nèi)參LEPTIN基因探針帶有Texas Red熒光基團(tuán)的探針HQ-129

15、4探針終濃度為100nM，KRAS基因擴(kuò)增檢測(cè)中采用帶有VIC熒光基團(tuán)的MGB探針HQ-1438，BRAF基因采用帶有FAM熒光基團(tuán)的MGB探針HQ-671，熒光探針終濃度均為250nM，為避免反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增，退火溫度選用60℃，循環(huán)數(shù)60cycles。
　　結(jié)論：
　　1.構(gòu)建基于內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高野生型抑制性特異性擴(kuò)增基因痕量突變實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法，選出適合結(jié)直腸腫瘤中KRAS基因痕量突變檢測(cè)的引物及探針，并

16、對(duì)反應(yīng)體系的退火溫度，循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，分別明確了加入內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段、KRAS基因檢測(cè)的引物及探針最佳反應(yīng)濃度。
　　2.構(gòu)建內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高野生型抑制性的BRAF基因基因痕量突變實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法，對(duì)引物、熒光探針和鎖核酸探針進(jìn)行一系列優(yōu)化，使該反應(yīng)體系可以對(duì)標(biāo)本中的野生型DNA模板進(jìn)行有效屏蔽，有較強(qiáng)選擇性擴(kuò)增能力，對(duì)BRAF基因突變識(shí)別靈敏度可以達(dá)到0.01％，滿足基因痕量突變檢測(cè)條件。
　　3.將

17、內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高野生型抑制性的基因痕量突變檢測(cè)方法運(yùn)用于50例臨床結(jié)直腸腫瘤組織標(biāo)本的KRAS和BRAF基因痕量突變檢測(cè)，本批標(biāo)本中突變率分別為36％和16％，該方法靈敏度特異性高、操作與成本比直接測(cè)序法更有優(yōu)勢(shì)，可廣泛應(yīng)用于臨床基因突變檢測(cè)，為腫瘤監(jiān)測(cè)及個(gè)體化用藥提供參考。
　　4.內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增片段提高野生型抑制性的基因痕量突變檢測(cè)方法結(jié)合微滴數(shù)字PCR可以檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA的痕量突變，通過對(duì)野生型基因擴(kuò)增的抑制，可以達(dá)