基因突變的檢測方法

1、基因突變的檢測方法基因突變的檢測方法基因突變的研已成為當今生命科學研究的熱點之一，檢測方法也隨之迅速發(fā)展。人類細胞癌基因的突變類型已如上所述，對于基因突變的檢測，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對于用該法法不能檢測的突變，只能應用復雜費時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應（polymerasechainreactionPCR）技術是突變研究中的最重大進展，使基因突變檢測技術有了

2、長足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術都是建立于PCR的基礎之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達二十余種，自動化程度也愈來愈高，分析時間大大縮短，分析結果的準確性也有很大很提高。其中包括單鏈構象多態(tài)性（singlestrcomfmationalpolymphismSSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplexanalysisHA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術及經(jīng)典突變檢測方法，可根據(jù)檢測目的和實驗室

3、條件選擇時參考。PCRSSCP法PCRSSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構象，一個堿基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構，這種二級結構依賴于其堿基組成，即使一個堿基的不同，也會形成不同的二級結構而出刺同的遷移率。由于該法簡單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCRSSCP法檢測小于200bp的PCR產(chǎn)物時，突

4、變檢出率可達70％95％，片段大于400bp時，檢出率僅為50％左右，該法可能會存在1％的假陽性率。應用PCRSSCP法應注意電泳的最佳條件，一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影響，同時該法不能測定突變的準確位點，還需通過序列分析來確定。Sarkar等認為對于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會提高其錄敏度。應用PCRSSCP檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測的

5、基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測第58外顯子即可發(fā)現(xiàn)85％以上的p53基因突變。由于該法簡便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。異源雙鏈分析法（HA）HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單

6、鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，兩者結合使用，可使突變檢出率提高到近100％。突變體富集PCR法（mutantenrichedPCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點，如Kras基因第12密碼子的BstNI位點，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括Kras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴

7、增反應之間用相應的內切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。擴增。LCR產(chǎn)物檢測最初是通過這32p標記上游引物3`未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測敏感性達到200個靶分子。也可設計1個橫跨兩引物的檢測探針，用它與LCR產(chǎn)物進行雜交檢測。近年有應用熒光素、地高辛等非核素標記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡的方法，好微孔板夾心雜交

8、法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測單個堿基突變的能力，因此被應用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結合用以提高其敏感性。等位基因特異性擴增法（AllelespecificamplificationASA）ASA于1989年建立，是PCR技術應用的發(fā)展，也稱擴增阻礙突變系統(tǒng)（amplificationrefractymutationsystemARMS）、等位基因特性PCR（allelespecificPCRASPCR）

9、等，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設計兩個5`端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進行兩個平行PCR，吸有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3`端則導致PCR不能延伸，則稱為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位基因突變位點。ASA法的檢出率依賴于反應條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DN

10、A有氏配時錯配延伸，特別是當錯配堿基為G：T時，這時可通過調整實驗條件如引物靶DNA，TaqDNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。在反應體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴增。還可通過在引物3`端的第二個堿基引入一個錯配堿基，使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸。RNA酶A切割法（RNaseAcleavage）在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離

11、。當RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，RNaseA在錯配處的切割效率很低，甚至不切割，而當錯配堿基為嘧啶時，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個條鏈，突變檢出率只有30％，如同時分析正義和反義二條鏈，檢出率可達70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復雜性，但可用于12kb的大片段進行檢測，并能確定突變位點。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對未知突變進行分析。染色體原位雜交（Insituhybridizationof

12、chromosome）染色體發(fā)現(xiàn)距今已有150多年的歷史，染色體檢測被廣泛用于動、植物及人類的細胞遺傳學研究，隨著染色體分技術和分子生物學技術的發(fā)展。染色體研究范圍也不斷擴大，特別是用于腫瘤分子診斷。腫瘤細胞的染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學基礎方面，原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關，腫瘤細胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸變，如缺失、重復、易位、重排、單體斷裂及核內復制等；繼發(fā)性變化主要是腫

13、瘤細胞核型的改變。染色體的檢測對于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測方法進展很快，檢測的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。熒光原位雜交技術（fluescentinsituhybridiaationFISH）創(chuàng)建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應用核素標記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測雜交信號。應用核素標記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百堿基的單拷貝靶核