rhALR在大鼠肝部分切除及部分肝移植術(shù)后肝再生中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：建立大鼠肝部分切除及部分肝移植動物模型，觀察大鼠40％肝切除組與60％肝移植組術(shù)后肝再生的差異性；在建立穩(wěn)定的大鼠肝部分切除及部分肝移植模型的基礎(chǔ)上，術(shù)后腹腔注射重組人肝再生增強因子(Recombinate human augmenter of liver regeneration，rhgLS)治療，通過對術(shù)后不同觀察時點大鼠常規(guī)肝功能、肝細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原標(biāo)記指數(shù)(proliferating cell nuclear antig

2、en labeling index，PCNA LI)，肝細(xì)胞增殖指數(shù)(Proliferation Index，PI)，凋亡指數(shù)(Apoptotic Index，AI)的比較，初步觀察rhALR對術(shù)后肝細(xì)胞再生的作用：進一步研究應(yīng)用rhALR與肝組織中IL-6mRNA、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1mRNA的表達(dá)及肝臟NK細(xì)胞殺傷活性變化的關(guān)系，探究rhALR在大鼠肝部分切除及部分肝移植術(shù)后促進肝再生的作用機制。 方法：

3、1、建立動物模型：切除肝左葉和雙尾葉，建立Wistar大鼠40％肝部分切除模型；采用改良“二袖套法”法建立Wistar-Wistar大鼠原位60％肝贓移植模型。 2、實驗分組：肝部分切除及部分肝移植術(shù)后分別分為實驗組和對照組。實驗組術(shù)后經(jīng)腹腔給予rhALR,40ug/kg，2次/d；對照組術(shù)后經(jīng)腹腔注射相同體積的注射鹽水，2次/d。即A組：肝部分切除術(shù)后thALR治療組，B組：肝部分切除術(shù)后注射用水對照組。C組：部分肝移植術(shù)后r

4、hALR治療組，D組：部分肝移植術(shù)后注射用水對照組。 3、檢測項目及方法：各組分別在術(shù)后第1、2、3、5、7d隨機挑取5只大鼠處死，采血檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)，免疫組織化學(xué)法檢測肝細(xì)胞PCNA LI的變化，流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞AI和肝細(xì)胞PI的變化。實時熒光定量RT-PCR檢測肝組織IL-6 mRNA，Cyclin-D1 mRNA的表達(dá)量。MTT比色法檢測肝臟自然殺傷細(xì)胞(Naturalkiller ce

5、lls，NK cells)殺傷活性的變化。 4、所有數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(mean士SD)表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，各觀察時點組間比較采用單因素方差分析中最小顯著差值法(LSD)，P<0.05設(shè)為差異具有顯著性意義。 結(jié)果： ①通過大量的手術(shù)操作訓(xùn)練，成功建立起穩(wěn)定的大鼠肝部分切除及部分肝移植實驗?zāi)Ｐ?。A、B組間手術(shù)時間、術(shù)中出血量相比較無明顯差異；C、D組間手術(shù)時間、術(shù)中出血量、供肝冷保存時間、受體無

6、肝期時間相比較無明顯差異。 ②血清ALT檢測：A、B組間相比較，術(shù)后第1 d A組血清ALT顯著低于B組，其余時點比較無顯著性差異。C、D組間相比較，術(shù)后第1，2 d C組血清ALT顯著低于D組，其余時點比較無顯著性差異。兩個對照組之間比較，D組術(shù)后第1、2d的血清ALT均顯著高于B組。 ③血清ALB測定：A、B組間相比較，術(shù)后第7 d A組血清ALB顯著高于B組，其余時點比較無顯著性差異，C、D組間相比較，術(shù)后第5，7

7、 d C組血清ALB顯著高于D組，其余時點比較無顯著性差異。兩個對照組之間比較，D組術(shù)后各時點的血清ALB均顯著低于B組。 ④肝細(xì)胞PCNA LI的變化：四組中.PCNA LI的高峰均在術(shù)后第2 d。肝切除組中，A組術(shù)后第1，2，3，5d的PCNA U均明顯高于B組同一時點的PCNAU(P<0.05)；肝移植組中C組術(shù)后第1，2，3，5d的PCNA LI均明顯高于D組同一時點的PCNA LO(P<0.05)，當(dāng)術(shù)后第7 d時，各

8、組的PCNA LI都降到較低的水平，且組間比較無顯著性差異。兩對照組的PCNA LI進行比較，D組術(shù)后第1d的PCNA LI明顯低于同時點B組的PCNA LI(P<0.05)，而其他觀察時點的PCNA LI則無顯著性差異。 ⑤肝細(xì)胞AI的變化：各組肝細(xì)胞AI高峰均在術(shù)后第2 d，A組術(shù)后第2d的肝細(xì)胞AI明顯低于B組同一時點的肝細(xì)胞AI(P<0.05)，C組術(shù)后第2d的肝細(xì)胞AI明顯低于D組同一時點的肝細(xì)胞AI(P<0.05)，

9、而其余觀察時點組間的肝細(xì)胞AI則無顯著性差異。兩對照組的肝細(xì)胞AI進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D組術(shù)后第1、2、3、5d的肝細(xì)胞AI均明顯高于同時點B組的肝細(xì)胞AI(P<0.05)，而術(shù)后第7d的肝細(xì)胞AI則無顯著性差異。 ⑥肝細(xì)胞PI的變化：A組術(shù)后第2、3 d的肝細(xì)胞PI明顯高于B組同一時點的PI(P<0.05)，C組術(shù)后第2 d的PI明顯高于D組同一時點的PI(P<0.05)，其余觀察時點的PI則無顯著性差異。兩對照組的PI進行比較

10、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D組術(shù)后第1d的PI明顯低于同時點B組的PI(P<0.05)，第2d無顯著性差異，術(shù)后第3d的PI卻是D組明顯高于B組，其余觀察時點的PI均無顯著性差異。 ⑦肝組織IL-6 mRNA表達(dá)的變化：各組IL-6mRNA表達(dá)的高峰均出現(xiàn)在術(shù)后第1天，其后隨著時間的推移，表達(dá)量逐漸降低。A組與B組在各相同觀察時點間比較均無顯著性差異，C組與D組在各相同觀察時點間比較也均無顯著性差異(P>0.05)，兩個對照組間比較，D組術(shù)后第

11、1d的IL--6 mRNA表達(dá)明顯低于B組，而其余時點之間比較無顯著性差異。 ⑧肝組織Cyclin D1 mRNA表達(dá)的變化：A組術(shù)后第1d CyclinD1 mRNA表達(dá)明顯高于B組同時點的表達(dá)。C組術(shù)后第1dCyclinD1 mRNA表達(dá)明顯高于D組同時點的表達(dá)，其余各觀察時點間比較均無顯著性差異(P>0.05)，兩個對照組間比較，D組術(shù)后第1dCyclinD1 mRNA表達(dá)明顯低于B組同時點的表達(dá)(P<0.05)，術(shù)后第2

12、 d無差別，第3 d卻是D組CyclinD1 mRNA表達(dá)明顯高于B組同時點的CyclinDl mRNA表達(dá)(P>0.05)。其后隨著時間的推移，表達(dá)量逐漸降低。 ⑨肝組織NK細(xì)胞殺傷活性的變化：A組術(shù)后第1，3 d的NK，細(xì)胞殺傷活性明顯低于B組相同時點的NK細(xì)胞殺傷活性，第5 d則無顯著性差異；C組只有術(shù)后第1 d的NK細(xì)胞殺傷活性明顯低于D組相同時點的NK細(xì)胞殺傷活性，第3，5 d則無顯著性差異；兩個對照組間比較，即D組術(shù)

13、后第1、3、5d的NK．細(xì)胞殺傷活性均明顯低于B組同一時點的NK細(xì)胞殺傷活性(P<0.05)。 結(jié)論： ①大鼠肝部分切除模型建立成功，組間實驗指標(biāo)比較具有可比性；大鼠部分肝移植模型穩(wěn)定可靠，組間實驗指標(biāo)比較具有可比性。 ②大鼠部分肝移植術(shù)后肝細(xì)胞的再生較肝部分切除術(shù)后的肝細(xì)胞再生過程相對延遲。 ③肝部分切除及部分肝移植術(shù)后應(yīng)用rhALR可以明顯促進肝細(xì)胞的再生，降低血清ALT，起到穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護肝功能的

14、作用。 ④部分肝移植術(shù)后肝再生較肝部分切除術(shù)后肝再生延遲現(xiàn)象的發(fā)生可能與部分肝移植術(shù)后肝臟IL-6mRNA，Cyclin D1mRNA的表達(dá)量較肝部分切除術(shù)后降低，及部分肝移植術(shù)后肝臟NK細(xì)胞活性較肝部分切除術(shù)后增高有關(guān)。 ⑤rhALR促進大鼠肝部分切除及部分肝移植術(shù)后的肝再生可能并不是通過上調(diào)啟動階段重要因子IL-6 mRNA的表達(dá)而發(fā)揮作用；而是通過上調(diào)增殖階段重要因子CyclinD1mRNA的表達(dá)而發(fā)揮作用。