支氣管哮喘患者氣道和外周血IL-25的表達(dá)水平與哮喘表型關(guān)系的研究.pdf

1、第一部分哮喘患者氣道上皮IL-25及其受體IL-17RB的表達(dá)
　　目的：檢測(cè)支氣管哮喘患者纖支鏡氣道上皮刷片細(xì)胞及氣道活檢組織中IL-25及其受體IL-17RB的mRNA水平和蛋白表達(dá)情況，探索IL-25及其受體IL-17RB的表達(dá)部位。
　　方法：我們選取43例支氣管哮喘患者及21例健康對(duì)照者作為研究對(duì)象，首先統(tǒng)計(jì)納入研究的研究對(duì)象的一般特征資料，記錄所有受試者的肺功能測(cè)量指標(biāo) FEV1％預(yù)計(jì)值和PD20值（引起通氣功能

2、指標(biāo)FEV1下降20%時(shí)的激發(fā)劑累積劑量）、外周血總IgE含量及外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目。隨后，我們通過(guò)纖維支氣管鏡檢查對(duì)所有受試者進(jìn)行氣道上皮細(xì)胞刷片及氣道組織活檢，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）方法檢測(cè)氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25及氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA表達(dá)水平，利用活檢組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) IL-25及其受體 IL-17RB的蛋白表達(dá)情況，并且在顯微鏡下計(jì)數(shù)免疫組織化學(xué)染色的切片中

3、IL-25及其受體IL-17RB染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)相關(guān)性分析評(píng)價(jià)氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA水平與氣道活檢組織中 IL-17RB的 mRNA水平之間的相關(guān)關(guān)系、氣道上皮刷片細(xì)胞中 IL-25的mRNA水平與IL-25染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，以及IL-25染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)與IL-17RB染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)果：支氣管哮喘患者的肺功能FEV1%預(yù)計(jì)值和PD20值顯著低于健康對(duì)照者。而外周血總I

4、gE含量及外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目則明顯高于健康對(duì)照者，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。同時(shí)，real-time PCR方法檢測(cè)氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25及氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA表達(dá)水平的結(jié)果顯示：支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細(xì)胞中 IL-25的 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照者，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）；且氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA表達(dá)水平也明顯高于正常對(duì)照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、（P=0.027）。此外，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法，我們看到，IL-25及其受體IL-17RB染色陽(yáng)性的細(xì)胞主要是氣道上皮細(xì)胞，且支氣管哮喘患者的組織切片中IL-25及其受體IL-17RB染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002和P<0.0001）。與正常對(duì)照者相比，支氣管哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞內(nèi)，IL-25及其受體IL-17RB的蛋白表達(dá)明顯增高，棕黃色沉積明顯，尤其以IL-25的表達(dá)增高更明顯。此

6、外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示：支氣管哮喘患者氣道刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA水平與氣道活檢組織中IL-17RB的mRNA水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.619，P<0.001)；支氣管哮喘患者氣道刷片細(xì)胞中 IL-25的mRNA水平與免疫組織化學(xué)方法中 IL-25染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目呈顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.75，P<0.0001)；且氣道活檢組織中IL-25的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與IL-17RB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也呈顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.5

7、5，P=0.0003)。
　　結(jié)論：支氣管哮喘患者的IL-25及其受體IL-17RB主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞。與對(duì)照組相比，一部分哮喘患者氣道上皮細(xì)胞IL-25及其受體IL-17RB的表達(dá)明顯增加。
　　第二部分IL-25的表達(dá)水平與支氣管哮喘患者的氣道高反應(yīng)性、氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥、過(guò)敏狀態(tài)、粘液分泌以及氣道重塑之間的關(guān)系
　　目的：統(tǒng)計(jì)所有納入研究的受試者的肺功能測(cè)量指標(biāo)、外周血嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目、外周血總 IgE含量

8、、過(guò)敏原皮試情況及氣道活檢組織的基底膜厚度，檢測(cè)氣道粘液Muc5Ac和Muc5B的表達(dá)情況，觀察支氣管哮喘患者與健康對(duì)照者以及不同的支氣管哮喘患者之間上述各指標(biāo)的差異，探討IL-25的表達(dá)水平與支氣管哮喘患者的氣道高反應(yīng)性、氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥、過(guò)敏狀態(tài)、粘液分泌以及氣道重塑之間的關(guān)系。方法：綜合第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分層分析，我們發(fā)現(xiàn)，僅有一部分（約50%）的支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA水平明顯升高，而另一部分哮

9、喘患者的IL-25 mRNA水平與健康對(duì)照者相比無(wú)明顯差異。因此，依據(jù)支氣管氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA表達(dá)水平，我們將哮喘患者分為“IL-25-high”和“IL-25-low”兩個(gè)亞型。同時(shí)，與氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA表達(dá)水平一致，也僅有部分哮喘患者活檢組織中 IL-17RB的mRNA水平，以及部分哮喘患者的 IL-25及其受體IL-17RB染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目顯著高于正常對(duì)照者。我們選取支氣管哮喘患者及健康對(duì)

10、照者作為研究對(duì)象，記錄所有受試者的年齡、性別、體重指數(shù)等基本信息資料。通過(guò)肺功能+激發(fā)/舒張?jiān)囼?yàn)檢測(cè)所有受試者的肺通氣功能情況以及激發(fā)試驗(yàn)時(shí)引起肺通氣功能指標(biāo)FEV1下降20%的激發(fā)劑累積劑量（PD20）和舒張?jiān)囼?yàn)時(shí)FEV1增加的量或比例。通過(guò)纖維支氣管鏡檢查獲取受試者支氣管氣道粘膜的活檢組織，進(jìn)行石蠟包埋活檢組織切片，HE染色后在光鏡下進(jìn)行活檢組織中嗜酸性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)及氣道基底膜厚度的測(cè)定。記錄研究對(duì)象外周血中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目和外周

11、血總IgE的含量。利用過(guò)敏原皮試評(píng)定測(cè)定支氣管哮喘患者和健康對(duì)照者的過(guò)敏狀態(tài)。通過(guò) real-time PCR和雙重免疫熒光染色檢測(cè)氣道粘液Muc5Ac和Muc5B的分泌情況。
　　結(jié)果：“IL-25-high”和“IL-25-low”兩個(gè)不同亞型的支氣管哮喘患者在年齡、性別、體重指數(shù)和肺功能（FEV1%預(yù)計(jì)值）方面的比較無(wú)明顯差異，但“IL-25-high”支氣管哮喘患者的肺功能 PD20水平卻明顯低于“IL-25-low”支氣

12、管哮喘患者和正常對(duì)照者(P=0.0048)。然而，“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道活檢組織及外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目則明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者（P值分別為0.003和0.045，）和正常對(duì)照者，且“IL-25-high”支氣管哮喘患者外周血總IgE水平和過(guò)敏原皮試陽(yáng)性的個(gè)數(shù)也均明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者（P值分別為0.001和0.018）和正常對(duì)照者。我們通過(guò)real-time PCR檢測(cè)

13、氣道刷片細(xì)胞中粘液的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道粘液 Muc5Ac的 mRNA表達(dá)水平明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者（P=0.003）和正常對(duì)照者（P<0.0001），而 Muc5B的表達(dá)卻剛好相反（P值均<0.0001）。通過(guò)雙重免疫熒光染色，我們可以看到，與正常對(duì)照者相比，“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道粘液Muc5Ac的蛋白表達(dá)明顯增高，而粘液 Muc5B低表達(dá)或不表達(dá)，而

14、“IL-25-low”哮喘患者則呈現(xiàn)完全相反的表達(dá)情況，即氣道粘液Muc5B的蛋白表達(dá)明顯增高，而粘液Muc5Ac低表達(dá)或不表達(dá)。此外，“IL-25-high”支氣管哮喘患者氣道活檢組織標(biāo)本粘膜下的基底膜厚度明顯高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者和正常對(duì)照者，且“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者氣道粘膜下基底膜厚度的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0006）。
　　結(jié)論：根據(jù)氣道上皮細(xì)胞 IL-25

15、的表達(dá)水平可以把哮喘患者分為“IL-25-high”和“IL-25-low”兩個(gè)亞型?！癐L-25-high”支氣管哮喘患者有更明顯的氣道高反應(yīng)性和更嚴(yán)重氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，且氣道粘液分泌明顯增多，氣道重塑情況也更顯著。
　　第三部分“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者對(duì)吸入激素治療的反應(yīng)性
　　目的：通過(guò)檢測(cè)支氣管哮喘患者外周血血漿中IL-25的含量，評(píng)價(jià)支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-2

16、5的mRNA表達(dá)水平與外周血血漿中IL-25的含量的相關(guān)性。然后，通過(guò)比較“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者治療前后外周血血漿中IL-25的變化水平、經(jīng)吸入激素治療后肺功能（FEV1和PD20）的改善情況以及支氣管哮喘的臨床癥狀評(píng)估狀態(tài)，探討兩種亞型的支氣管哮喘患者與吸入激素治療反應(yīng)性之間的關(guān)系，評(píng)價(jià)“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者經(jīng)吸入激素治療后的治療效果。
　　方法：選

17、取43例就診于同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科門(mén)診的支氣管哮喘患者和21例健康對(duì)照者作為研究對(duì)象，收集各研究對(duì)象的外周血血漿標(biāo)本，并規(guī)律給予支氣管哮喘患者吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德（200ug/次，一天兩次）治療，療程8周。首先依據(jù)氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA表達(dá)水平將支氣管哮喘患者分為“IL-25-high”支氣管哮喘和“IL-25-low”支氣管哮喘兩個(gè)亞型，然后再以外周血血漿中IL-25的含量55pg/ml為臨界點(diǎn)，將>55pg

18、/ml的研究對(duì)象歸為“plasma IL-25-high”支氣管哮喘患者，≤55 pg/ml的歸為“plasma IL-25-low”支氣管哮喘患者。通過(guò)檢測(cè)不同分類(lèi)及亞型的支氣管哮喘患者在吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療8周過(guò)程中外周血血漿中IL-25的變化水平以及肺功能測(cè)量指標(biāo)FEV1和PD20的變化情況，了解支氣管哮喘患者氣道上皮細(xì)胞和外周血血漿中IL-25的表達(dá)水平與吸入性糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)性之間的關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)支氣管哮喘控制測(cè)試

19、（ACT）和支氣管哮喘控制調(diào)查問(wèn)卷（ACQ-5），在支氣管哮喘患者初診、治療第4周和第8周時(shí)分別進(jìn)行支氣管哮喘患者的臨床癥狀評(píng)分，了解“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者在布地奈德吸入治療8周過(guò)程中支氣管哮喘臨床癥狀（喘息、呼吸困難、夜間發(fā)作次數(shù)等）的改善情況，以評(píng)價(jià)“IL-25-high”和“IL-25-low”支氣管哮喘患者對(duì)吸入性糖皮質(zhì)激素的治療效果。
　　結(jié)果：ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：不同的支氣管

20、哮喘患者外周血血漿中IL-25的含量有較大差異，與支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA表達(dá)相一致，僅有一部分（約50%）哮喘患者外周血血漿中IL-25的表達(dá)水平明顯升高，而另一部分哮喘患者外周血血漿中IL-25的表達(dá)水平與健康對(duì)照者相比無(wú)明顯差異，且“IL-25-high”支氣管哮喘患者的IL-25含量顯著高于“IL-25-low”支氣管哮喘患者。此外，支氣管哮喘患者氣道上皮刷片細(xì)胞中IL-25的mRNA表達(dá)水平與外周血

21、血漿中IL-25的含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)為0.743，P<0.0001）?；诖?，我們依據(jù)外周血血漿中 IL-25的含量55pg/ml為臨界點(diǎn)，將支氣管哮喘患者分為“plasma IL-25-high”和“plasma IL-25-low”支氣管哮喘兩個(gè)亞型。與治療前相比，在吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療第4周時(shí)，“IL-25-high”支氣管哮喘外周血血漿中IL-25的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，而在“IL-25-low”支氣

22、管哮喘患者外周血血漿中，這種下降趨勢(shì)卻并不明顯，甚至有個(gè)別樣本出現(xiàn)不降反升的情況。經(jīng)吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療第8周時(shí)，“IL-25-high”支氣管哮喘外周血血漿中IL-25的表達(dá)水平仍有緩慢下降趨勢(shì)。同時(shí)，在吸入性糖皮質(zhì)激素布地奈德治療第4周和第8周時(shí)，“IL-25-high”支氣管哮喘患者肺功能 FEV1和激發(fā)試驗(yàn) PD20值的增加量明顯升高，而“IL-25-low”支氣管哮喘患者的肺功能FEV1和激發(fā)試驗(yàn)PD20值變化均不明顯

23、，兩組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。此外，經(jīng)過(guò)4周和8周的吸入性糖皮質(zhì)激素治療后，“plasma IL-25-high”支氣管哮喘患者肺功能 FEV1和激發(fā)試驗(yàn) PD20值的增加量明顯高于“plasma IL-25-low”支氣管哮喘患者。通過(guò)ACT和ACQ-5問(wèn)卷調(diào)查，我們也看到，一部分對(duì)吸入性糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)性更敏感的“IL-25-high”支氣管哮喘患者在布地奈德吸入治療8周過(guò)程中哮喘癥狀（喘息、呼吸困難、夜間發(fā)作

24、次數(shù)等）得到明顯改善，其ACT評(píng)分較高，ACQ-5評(píng)分偏低；而“IL-25-low”支氣管哮喘患者在布地奈德吸入治療8周過(guò)程中哮喘癥狀改善并不明顯，其ACT評(píng)分較低，ACQ-5評(píng)分偏高。
　　結(jié)論：“IL-25-high”支氣管哮喘對(duì)吸入性糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)性明顯優(yōu)于“IL-25-low”支氣管哮喘。血漿中IL-25的水平與氣道上皮細(xì)胞中IL-25表達(dá)水平有顯著相關(guān)性，且吸入性糖皮質(zhì)激素的治療降低“IL-25-high”支氣管哮