貓眼草HPLC指紋圖譜的建立及其相關(guān)成分的腸吸收、經(jīng)皮吸收和藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、目的：貓眼草為我國(guó)中草藥，為了能深入地開發(fā)利用貓眼草的藥用資源，全面了解該藥材的臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，本次以貓眼草為研究對(duì)象，建立其質(zhì)量控制方法以及對(duì)相關(guān)成分進(jìn)行大鼠體外腸吸收、經(jīng)皮吸收和體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征研究。
　　方法：
　?。?）從全國(guó)各地收集15批不同產(chǎn)地的貓眼草藥材，采用Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，以甲醇-0.2％磷酸水溶液為流

2、動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，建立貓眼草的高效液相指紋圖譜的方法。采用本方法對(duì)15批來(lái)源不同產(chǎn)地的貓眼草藥材進(jìn)行指紋圖譜的研究，并結(jié)合中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，聚類分析和主成分分析這兩種化學(xué)模式識(shí)別的方法，從整體上辨識(shí)圖譜，對(duì)來(lái)源不同產(chǎn)地不同批次的貓眼草指紋圖譜進(jìn)行分類，區(qū)分藥材的歸屬性。
　　（2）采用Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254

3、nm，以甲醇-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，建立高效液相色譜法同時(shí)定量分析來(lái)源不同產(chǎn)地的15批貓眼草藥材中的沒食子酸、秦皮乙素、金絲桃苷、槲皮素和山萘酚。
　　（3）采用大鼠離體外翻腸囊法對(duì)不同濃度的貓眼草水提取物進(jìn)行腸吸收特征研究，以沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷為指標(biāo)性成分，建立HPLC法對(duì)腸道孵育后的貓眼草水提取物進(jìn)行組分分析。計(jì)算沒食子酸，秦皮乙素和金絲桃苷在大鼠十二指腸、空腸、回腸和結(jié)

4、腸四個(gè)腸段的單位腸管面積累積吸收量（Q）和吸收速率常數(shù)（Ka）以及表觀滲透系數(shù)（Papp）。
　?。?）采用Franz擴(kuò)散池，利用離體大鼠皮膚為滲透屏障，以30%乙醇生理鹽水為接收液，以沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷為指標(biāo)性成分，采用HPLC法檢測(cè)樣品，研究貓眼草水提取物的經(jīng)皮吸收以及加入不同濃度不同的滲透促進(jìn)劑（氮酮、冰片和丙二醇）的經(jīng)皮吸收。計(jì)算沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷三種成分的累積滲透量、透皮速率、增滲倍率和滲透系數(shù)。

5、r>　?。?）大鼠灌胃給予貓眼草水提取物低、中、高三個(gè)劑量（1.2 g/kg,2.4 g/kg,4.8 g/kg），采用HPLC法，檢測(cè)大鼠血漿中的沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷的血藥濃度，計(jì)算相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果：
　?。?）建立了貓眼草水提物的HPLC指紋圖譜，以金絲桃苷為內(nèi)參比峰，得到32個(gè)共有峰。利用對(duì)照品對(duì)比的方法，對(duì)指紋圖譜中5個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別鑒定為沒食子酸，秦皮乙素，金絲桃苷，槲皮素和山萘酚。對(duì)來(lái)

6、源于不同產(chǎn)地的15批貓眼草樣品得到的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度分析，聚類分析和主成分分析。結(jié)果顯示，來(lái)源于不同產(chǎn)地的15批貓眼草相似度在0.886~0.994之間，化學(xué)成分含量有一定的差異性，主要分為2類。
　?。?）沒食子酸、秦皮乙素、金絲桃苷、槲皮素和山萘酚的線性范圍分別為5~250μg/mL（r=0.9999），10~200μg/mL（r=0.9998），20~500μg/mL（r=0.9998），5~80μg/mL（r=0.9

7、999）和2~50μg/mL（r=0.9998）。結(jié)果表明，來(lái)源于不同產(chǎn)地的貓眼草藥材在含量上均有差異性。15批貓眼草藥材中沒食子酸、秦皮乙素、金絲桃苷、槲皮素、山萘酚量的含量分別為0.16~0.97 mg/g，0.95~1.27 mg/g，1.56~2.04 mg/g，0.32~0.46 mg/g和0.12~0.26 mg/g。該定量分析方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確。
　?。?）從腸道孵育液中檢測(cè)的色譜峰與藥材的指紋圖譜相比較，確定了來(lái)

8、源于貓眼草水提取物有17個(gè)，其中指認(rèn)了3個(gè)，分別鑒定為沒食子酸、秦皮乙素、金絲桃苷，并對(duì)這3種成分進(jìn)行腸吸收屬性研究。結(jié)果表明，各成分在不同腸段的累積吸收量隨樣本濃度和時(shí)間的增加而增加，其回歸相關(guān)系數(shù)（R2）均達(dá)到0.90以上，符合一級(jí)吸收速率。秦皮乙素和金絲桃苷在四個(gè)腸段的累積吸收量大小為十二指腸>空腸>回腸>結(jié)腸。沒食子酸在四個(gè)腸段的累積吸收量大小為空腸>十二指腸>回腸>結(jié)腸。各腸段的沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷的Ka隨著貓眼草水提

9、取物濃度的增加而增加。通過分析，在不同濃度的貓眼草水提物的條件下，3種成分的Papp無(wú)顯著性差異。沒食子酸在四個(gè)腸段，不同樣本濃度的Papp在1×10-6~1×10-5(cm/s)之間，金絲桃苷在十二指，空腸、回腸三個(gè)腸段，不同樣本濃度的Papp在1×10-6~1×10-5(cm/s)之間，秦皮乙素的Papp在十二指腸和空腸，不同樣本濃度的Papp在1×10-6~1×10-5(cm/s)之間。
　?。?）結(jié)果顯示，在未加入任何滲透

10、促進(jìn)劑的條件下，貓眼草提取物中的沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷的透皮速率分別0.649μg/cm2/h，0.845μg/cm2/h，2.283μg/cm2/h。加入不同濃度不同滲透促進(jìn)劑（氮酮、冰片、丙二醇）后，沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷累積滲透量和透皮擴(kuò)散速率均比未加滲透促進(jìn)劑提高。透皮速率數(shù)據(jù)顯示，3種成分的釋放量與時(shí)間成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.90以上，為一級(jí)擴(kuò)散。促滲效果隨著促滲劑的濃度增加而增加，單獨(dú)使用一種促滲透劑

11、在相同的濃度下，各促滲透劑對(duì)沒食子酸的促滲透效果大小為丙二醇>氮酮>冰片，對(duì)秦皮乙素和金絲桃苷的促滲透效果大小均為氮酮>冰片>丙二醇。促滲劑聯(lián)用使用的促滲效果均比單獨(dú)使用一種促滲劑高。
　　（5）從大鼠含藥血漿中檢測(cè)出19個(gè)峰，其中采用對(duì)照品法指認(rèn)了3個(gè)，分別為沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷，并對(duì)其進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征研究。沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷分離度良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾其測(cè)定。沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷濃度分別在0.0

12、2~10μg/mL、0.05~10μg/mL和0.15~180μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與血漿濃度均呈良好的線性關(guān)系（r>0.9995）。提取回收率均大于90%，批內(nèi)和批間的RSD均<10%，表明此方法靈敏，符合CFDA有關(guān)藥物代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)定實(shí)施細(xì)則的要求，可用于沒食子酸，秦皮乙素和金絲桃苷在血漿中的定量分析。大鼠分別灌胃給予貓眼草水提取物1.2 g/kg,2.4 g/kg和4.8 g/kg三個(gè)劑量，沒食子酸的Cmax分別為（4.284±

13、0.233） mg/L，（9.028±0.243）mg/L，（18.056±0.487）mg/L，Tmax分別為（1.500±0.000）h，（1.500±0.000）h，（1.500±0.000）h，AUC0-∞分別為（11.639±1.103）mg/L·h，（23.578±1.634）mg/L·h，（47.537±3.777）mg/L·h。秦皮乙素的Cmax分別為（4.005±0.163） mg/L，（7.933±0.346）mg/

14、L，（15.201±0.220）mg/L，Tmax分別為（0.250±0.000）h，（0.250±0.000）h，（0.250±0.000）h，AUC0-∞分別為（14.537±1.949）mg/L·h，（28.679±3.892）mg/L·h，（54.596±2.549）mg/L·h。金絲桃苷的Cmax分別為（3.081±0.134） mg/L，（5.268±0.673）mg/L，（10.083±0.708）mg/L，Tmax分別為

15、（0.500±0.000）h，（0.500±0.000）h，（0.500±0.000）h，AUC0-∞分別為（3.848±0.977）mg/L·h，（5.587±1.000）mg/L·h，（10.725±0.825）mg/L·h。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示，在給定的三個(gè)劑量范圍內(nèi)，沒食子酸、秦皮乙素和金絲桃苷三種成分的藥動(dòng)學(xué)具有線性動(dòng)力學(xué)的特征。
　　結(jié)論：本研究初步建立了貓眼草水提取物HPLC指紋圖譜，并結(jié)合多成分定量對(duì)貓眼草進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)

16、，來(lái)源于不同產(chǎn)地的貓眼草中的化學(xué)成分及其含量均具有一定的差異性，這種差異性的產(chǎn)生可能與植物本身的生長(zhǎng)環(huán)境，如氣溫、土質(zhì)、陽(yáng)光、降雨量以及采收時(shí)間的不同有關(guān)。此外，對(duì)貓眼草水提物進(jìn)行大鼠腸吸收，體外經(jīng)皮吸收和體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征探討，沒食子酸，秦皮乙素和金絲桃苷這三種成分在體內(nèi)能夠吸收進(jìn)入血液，提示這三種成分可能是貓眼草發(fā)揮藥理作用的有效成分。這三種成分在腸道的吸收機(jī)制可能為被動(dòng)擴(kuò)散。本次研究為貓眼草提取物的劑型設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)，為該品