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文檔簡介
1、目的:
探討不同濃度的銀杏葉提取物(EGb761)對乙型肝炎病毒分泌抗原的作用,進(jìn)一步研究中藥在抗乙型肝炎病毒感染過程中的價(jià)值。
方法:
第一部分:
1.用MTT法檢測銀杏葉提取物對HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用。
2.用不同濃度的銀杏葉提取物作用于HepG2.2.15細(xì)胞,期間分不同的時(shí)間段(4d和6d)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用時(shí)間分辨免疫熒光分析(TRFIA)法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中乙肝
2、病毒表面抗原(HBsAg)及乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表達(dá)情況。用spss16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,分析EGb761對HepG2.2.15細(xì)胞分泌抗原的作用。
第二部分:用人乙型肝炎病毒(HBV)陽性血清和銀杏葉提取物作用于HL-7702細(xì)胞株和樹鼩原代肝細(xì)胞,在不同的時(shí)間點(diǎn)(4d和6d)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞DNA,用TRFIA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg;用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測細(xì)胞內(nèi)的HBV DN
3、A。
結(jié)果:
第一部分:
1.MTT實(shí)驗(yàn)顯示:分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天和第6天進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),檢測實(shí)驗(yàn)組吸光度值A(chǔ)(OD)與對照組吸光度值A(chǔ)(OD),經(jīng)單因素方差分析沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761干預(yù)后,第4天和第6天的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg吸光度 A值及HBeAg吸光度A值,明顯少于未加藥作用過的陽性對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的乙肝病毒抗原吸光度
4、A值,經(jīng)單因素方差分析,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
3.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761干預(yù)后,EGb761的濃度在55μg/ml~1750μg/ml的劑量范圍內(nèi),4d時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg吸光度A值小于6d時(shí)對應(yīng)藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg吸光度A值,4d時(shí)EGb761對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制率大于6d時(shí)對應(yīng)藥物濃度對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制率;而EG
5、b761的濃度在219μg/ml~1750μg/ml的劑量范圍內(nèi),雖然4d時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBeAg吸光度A值大于6d時(shí)對應(yīng)藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBeAg吸光度A值,但是4d時(shí)EGb761對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制率有大于6d時(shí)對應(yīng)藥物濃度對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制率。
4.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761作用4d和6d后,27μg/ml及以上的濃度范圍時(shí)測得的細(xì)胞
6、培養(yǎng)上清中的HBsAg吸光度A值與陽性對照組的吸光度A值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);219μg/ml及以上的濃度范圍時(shí)測得的細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBeAg吸光度A值與陽性對照組的吸光度A值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
第二部分:
銀杏葉提取物干預(yù)過的感染了人HBV的HL-7702細(xì)胞株和樹鼩原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg呈陽性,HL-7702細(xì)胞株培養(yǎng)上清中的HBsAg的吸光度A值在一倍稀釋濃度4d時(shí)與相應(yīng)
7、的陽性對照組A值比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA經(jīng)PCR后灰度值沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律變化趨勢。
結(jié)論:
1.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用EGb761的劑量在14μg/ml~1750μg/ml對 HepG2.2.15細(xì)胞的生長沒有明顯的毒性作用;
2.經(jīng)EGb761干預(yù)過4d和6d的HepG2.2.15細(xì)胞,EGb761的劑量濃度范圍在27μg/ml~1750μg/ml時(shí)對細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的HBsA
8、g的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);而在219μg/ml~1750μg/ml的劑量范圍內(nèi)時(shí)對細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的HBeAg的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);
3.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761作用4d和6d后,EGb761在較低的濃度范圍內(nèi)就可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞向培養(yǎng)上清中分泌HBsAg;而抑制細(xì)胞分泌HBeAg到培養(yǎng)上清中卻需要較高的藥物濃度,并且EGb761對HBsAg的抑制率有強(qiáng)于對HBeAg的抑制率
9、的趨勢。
4.經(jīng)EGb761干預(yù)過的HepG2.2.15細(xì)胞,4d時(shí)對乙肝抗原的抑制率有強(qiáng)于6d時(shí)抑制率的趨勢。
5.EGb761的濃度在27μg/ml時(shí)可能是抑制HBsAg分泌的最低有效劑量濃度,同樣EGb761的濃度在219μg/ml時(shí)可能是抑制HBeAg分泌的最低有效劑量濃度。
6.HL-7702細(xì)胞株可能能夠被人HBV陽性感染血清所感染,但是不能用其作為研究自然狀態(tài)下感染HBV的細(xì)胞模型。
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