去卵巢、糖皮質(zhì)激素、降鈣素對(duì)雌性大鼠骨強(qiáng)度影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一組以骨量減少或(和)骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)被破壞，骨強(qiáng)度下降，骨脆性增加、極易發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥的最終結(jié)局是脆性骨折，即骨質(zhì)疏松癥性骨折。骨質(zhì)疏松癥是目前世界上發(fā)病率、死亡率及醫(yī)療資源消耗較大的疾病之一。女性絕經(jīng)后激素水平下降和糖皮質(zhì)激素的長(zhǎng)期使用，是骨質(zhì)疏松癥的常見病因。目前，部分絕經(jīng)后女性由于各種其他疾病的原因需要長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素治療，兩種因素疊加對(duì)骨強(qiáng)度的影響研究甚

2、少，這正是我們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。降鈣素是治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物，其能有效的降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥性骨折風(fēng)險(xiǎn)，但其對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥是否有療效卻無一致意見，其是否適用于雌激素缺乏和糖皮質(zhì)激素共同作用所致的骨質(zhì)疏松癥等問題也沒有解決。在此基礎(chǔ)上，本課題以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10月齡SD大鼠為研究對(duì)象，分別建立大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型，大鼠糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥模型，大鼠去卵巢及糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松癥雙模型，對(duì)這三種模型進(jìn)行評(píng)定并對(duì)這三種模型進(jìn)行橫向比

3、較；深入探討此三種大鼠骨質(zhì)疏松癥模型建立后不同骨骼部位骨丟失敏感區(qū)的選擇；研究鮭魚降鈣素對(duì)骨質(zhì)疏松癥防治的有效性：并對(duì)大鼠此三種骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制、鮭魚降鈣素的防治作用機(jī)理進(jìn)行初步探討。為后續(xù)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。全文由三部分實(shí)驗(yàn)組成。
　　 第一章、骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)
　　 實(shí)驗(yàn)一：對(duì)雙能X線吸收法測(cè)定大鼠骨量的評(píng)價(jià)
　　 目的：探討雙能X線吸收法測(cè)量大鼠骨密度(Bone minerald

4、ensity，BMD)、骨礦含量(Bone mineral content，BMC)的精密度和準(zhǔn)確度。
　　 方法：用扇形束DXA重復(fù)測(cè)量20只SD大鼠不同骨骼區(qū)域BMD、BMC的變異系數(shù)評(píng)價(jià)精密度；測(cè)量18只大鼠骨礦含量和骨灰重比較評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度。
　　 結(jié)果：DXA測(cè)量BMD的CV為全身(0.74±0.40)％，第四腰椎(1.47±0.57)％，第五腰椎(1.38±0.54)％，第六腰椎(1.38±0.48)％，股骨(0

5、.54±0.28)％，脛骨(0.62±0.21)％，DXA測(cè)量BMC的CV全身(0.84±0.32)，第四腰椎(1.37±0.67)％，第五腰椎(1.48±0.54)％，第六腰椎(1.44±0.39)％，股骨(0.72±0.34)％，脛骨(0.57±0.32)％；BMC與骨灰重呈高度正相關(guān)，BMC顯著低于骨灰重。
　　 結(jié)論：DXA測(cè)量大鼠骨量是一種精密而有效的方法。
　　 實(shí)驗(yàn)二：雙能X線吸收法測(cè)定骨質(zhì)疏松癥大鼠模型骨

6、量變化敏感區(qū)的選擇
　　 目的：探討雙能X線吸收法(DXA)測(cè)定大鼠去卵巢后及大鼠接受糖皮質(zhì)激素后骨量變化的敏感區(qū)域。
　　 方法：30只44周齡SD雌性大鼠分別假性去卵巢(SHAM組)、摘除雙側(cè)卵巢(OVX組)或注射甲基強(qiáng)的松龍(2.5mg·kg-1·d-1)(PRED組)，應(yīng)用扇形束DXA(QDR-4500A)每4周測(cè)定一次全身骨密度(BMD)、骨礦含量(BMC)、骨骼面積(AREA)；術(shù)后12周處死，測(cè)定離體腰椎、

7、股骨、脛骨及其興趣區(qū)的BMD、BMC、AREA。
　　 結(jié)果：①術(shù)后8周開始OVX組體重顯著重于同齡SHAM組(8周時(shí)，P<0.05，12周時(shí)P<0.01)，術(shù)后4周開始PRED組體重顯著輕于同齡SHAM組(P<0.05)；②術(shù)后12周OVX組整體BMC顯著高于SHAM組(P<0.05)，術(shù)后8、12周OVX組整體BMC顯著高于PRED組(P<0.05)；③術(shù)后12周OVX組離體第5、6腰椎BMD及第6腰椎BMC顯著低于SHAM

8、組和PRED組(P<0.05)；PRED組離體各腰椎BMD、BMC、AREA與SHAM組無明顯差異；④術(shù)后12周與SHAM組比較，OVX組離體股骨(-7.45％)、股骨遠(yuǎn)端(-11.97％)和近端(-7.28％)、脛骨近端(-11.97％)BMD顯著降低(P<0.05)；其中股骨、股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端BMC也顯著降低(P<0.05)⑤術(shù)后12周與SHAM組比較，PRED組離體股骨及各區(qū)BMD、BMC、AREA無顯著性差異；整體脛骨及各區(qū)B

9、MD無顯著性差異；⑥術(shù)后12周與SHAM組比較，OVX組及PRED組脛骨中遠(yuǎn)端骨量增加。
　　 結(jié)論：第六腰椎、股骨遠(yuǎn)端及近端干骺端和脛骨近端干骺端是成熟期大鼠去卵巢后骨丟失的最敏感區(qū)域；成熟期大鼠接受甲基強(qiáng)的松龍后，皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量沒有顯著變化，DXA檢查難以發(fā)現(xiàn)其骨丟失情況。
　　 實(shí)驗(yàn)三：大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立與評(píng)定
　　 目的：建立并評(píng)定大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型，大鼠糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥模型，大鼠去卵

10、巢及糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松癥雙模型，并對(duì)這三種模型進(jìn)行橫向比較。
　　 方法：將70只44周齡SD雌性大鼠分為假手術(shù)組(SHAM組)；去卵巢組(OVX組)；注射甲潑尼龍大鼠組(PRED組)；去卵巢+注射甲潑尼龍大鼠組(OVX+PRED組)；降鈣素干預(yù)去卵巢大鼠組(OVX+C組)；降鈣素干預(yù)甲潑尼龍?zhí)幚泶笫蠼M(PRED+C組)；降鈣素干預(yù)去卵巢+甲潑尼龍注射組(OVX+PRED+C組)，每組10只大鼠。后3組用于第四章實(shí)驗(yàn)。OVX組切

11、除雙側(cè)卵巢；SHAM組切除少許脂肪組織；PRED組每日皮下注射甲潑尼龍2.5mg/kg/d；OVX+PRED組同時(shí)接受去卵巢術(shù)及每日皮下甲潑尼龍注射2.5mg/kg/d。每隔4周行一次活體骨密度檢測(cè)。術(shù)后3月，取血后處死。取椎骨、脛骨、股骨，去凈軟組織。分別行離體骨骨密度檢測(cè)、骨組織計(jì)量學(xué)測(cè)量、三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)、壓縮實(shí)驗(yàn)、MlcroCT掃描等。所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：手術(shù)順利，術(shù)后3月，OVX后體重增加明顯

12、，注射糖皮質(zhì)激素后體重明顯降低，與SHAM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)合模型大鼠體重變化不顯著。子宮和子宮系數(shù)在行去卵巢手術(shù)的兩組大鼠明顯降低(P<0.05)。
　　 1、離體骨骨密度：股骨和脛骨按測(cè)量圖像的長(zhǎng)度，將其等分成7個(gè)區(qū)(R1～R7)，各區(qū)被稱為感興趣區(qū)(ROI)。與SHAM組比較，OVX組腰椎、整體股骨及其遠(yuǎn)端(FROI-1、2)和近端(FROI-7)、整體脛骨及其近端(IROI-1～3)BMD顯著丟失；PRED組骨丟

13、失率不顯著；OVX+PRED組骨丟失區(qū)域更廣泛。
　　 2、骨組織計(jì)量學(xué)分析表明：與SHAM組比較，OVX組、PRED組和OVX+PRED組小梁骨體積(BV/TV)和骨小梁數(shù)目(Tb.N)顯著減少，骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著增加。OVX組Tb.Th沒有顯著的變化，BFR增加了118.94％，MAR增加了74.07％；PRED組Tb.Th降低了15.96％，BFR降低了28.46％，MAR降低了24.69％；OVX+PRED組

14、Tb.N降低了51.48％，BFR卻增加了29.67％，而MAR卻無明顯變化。
　　 3、uCT測(cè)定大鼠脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，其脛骨近端皮質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)改變不顯著。去卵巢后，大鼠松質(zhì)骨骨小梁連接性迅速降低而骨小梁厚度變薄不明顯；而激素處理的大鼠松質(zhì)骨骨小梁厚度變薄明顯；兩因素同時(shí)處理大鼠時(shí)，松質(zhì)骨各指標(biāo)迅速惡化。
　　 4、股骨干三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去卵巢組最大載荷、最大應(yīng)力、彈性載荷、彈性應(yīng)力與SHAM組接近，差異不

15、顯著(P>0.05)。PRED組與OVX+PRED組各項(xiàng)力學(xué)性能指標(biāo)均低于假手術(shù)組(P<0.05)。在第二腰椎中，OVX組、OVX+PRED組最大載荷與彈性模量顯著低于假手術(shù)組(p<0.01)。PRED組最大載荷顯著低于SHAM組(p<0.05)，其最大載荷和彈性模量顯著高于OVX+PRED組(p<0.01)。OVX+PRED組的最大載荷和彈性模量低于SHAM組，但無顯著性差異。
　　 結(jié)論：造模操作簡(jiǎn)便易行，死亡率低。OVX后

16、體重增加明顯，注射糖皮質(zhì)激素后體重明顯降低，與SHAM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)合模型大鼠體重變化不顯著。造模三個(gè)月后，大鼠的骨量降低，骨小梁結(jié)構(gòu)改變，骨生物力學(xué)性能變差：提示骨組織結(jié)構(gòu)改變，材料性能亦有較大變化。確定了三種SD雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥模型骨丟失和骨結(jié)構(gòu)改變的敏感區(qū)域，為后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)。對(duì)骨量、骨結(jié)構(gòu)按影響程度排序如下：去卵巢+注射甲潑尼龍)去卵巢)注射甲潑尼龍。三種SD雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥模型造模成功。
　　

17、第二章、降鈣素干預(yù)骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的研究
　　 目的：評(píng)定降鈣素對(duì)大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型，大鼠糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥模型，大鼠去卵巢及糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松癥雙模型的預(yù)防效果。
　　 方法：將在第三章實(shí)驗(yàn)一中已隨機(jī)分組的30只41周齡SD雌性大鼠予以降鈣素皮下注射4mg/kg/d，其分別是：降鈣素干預(yù)去卵巢大鼠組(OVX+C組)；降鈣素干預(yù)甲潑尼龍注射大鼠組(PRED+C組)；降鈣素干預(yù)去卵巢+甲潑尼龍注射大鼠組(OVX

18、+PRED+C組)，每組10只大鼠。其他實(shí)驗(yàn)方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同第三章實(shí)驗(yàn)一。
　　 結(jié)果：降鈣素干預(yù)的三組體重與對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組比較，體重有降低的趨勢(shì)，子宮重量和子宮系數(shù)無明顯變化。右側(cè)脛骨灰重和全身骨密度在各組間無有意義的顯著性改變。
　　 1、離體骨骨密度：在腰椎，降鈣素干預(yù)各組與對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組之間，BMD、BMC、AREA無顯著差異。
　　 在股骨，OVX+C組與OVX組比較，整體股骨、FROI-1的BMD、

19、BMC；FROI-2的BMD；FROI-5、6的BMC顯著降低。在PRED+C組，其FROI-1、2的BMD顯著低于PRED組和SHAM組，其他區(qū)域BMD，BMC無顯著差異。在OVX+PRED+C組，整體股骨BMD仍顯著低于SHAM組，但是與OVX+PRED組比較，股骨整體，F(xiàn)ROI-1、2的BMD顯著增加，而且FROI-1、2區(qū)域恢復(fù)到接近SHAM組水平。
　　 在脛骨，OVX+C組脛骨整體和TROI-1的BMD、BMC顯著低

20、于SHAM組，整體脛骨BMC顯著低于OVX組；PRED+C組各個(gè)骨骼區(qū)域和SHAM組、PRED組比較，無顯著差異性；OVX+PRED+C組，整體脛骨BMD顯著低于SHAM組，F(xiàn)ROI-1、2區(qū)的BMD和FROI-1區(qū)的BMC顯著高于OVX+PRED組。
　　 2、骨組織計(jì)量學(xué)分析表明：降鈣素干預(yù)后，三組的骨小梁微結(jié)構(gòu)指標(biāo)均得到了改善，甚至部分優(yōu)于SHAM組。OVX+C組與OVX組比較，BV/TV增加了111.95％，Tb.Sp降

21、低了55.41％，Tb.N增加了62.20％，Tb.Th、BFR、MAR顯著降低；與SHAM組比較，BV/TV顯著性增加13.16％。PRED+C組與PRED比較，BV/TV、Tb.Th、Tb.N分別增加了70.60％、27.23％、39.30％，并且Tb.Sp降低了39.70％，BV/TV比SHAM組也顯著性增加。OVX+PRED+C組與OVX+PRED比較，BV/TV、Tb.Th、Tb.N分別增加了142.91％、20.59％、99

22、.06％，Tb.Sp降低了66.46％，各指標(biāo)與SHAM組比較均無顯著差異。
　　 3、uCT測(cè)定大鼠脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)分析表明，降鈣素干預(yù)后，三組的骨小梁微結(jié)構(gòu)指標(biāo)均得到了改善。OVX+C組較OVX組骨小梁數(shù)目有增加，間距變小。PRED+C組與PRED組比較，骨小梁明顯增厚，分布規(guī)則，與SHAM組比較，無明顯區(qū)別；。OVX+PRED+C組與OVX+PRED組比較，骨小梁數(shù)目明顯增加，厚度明顯增加，分布較規(guī)則，未見明顯的空洞；

23、與SHAM組比較，骨小梁間距稍寬，分布稍不規(guī)則。
　　 4、骨力學(xué)性能在降鈣素干預(yù)后有一定改善。OVX+C組大鼠股骨干三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)各參數(shù)與OVX組、SHAM組大鼠之間無明顯差異；在壓縮實(shí)驗(yàn)中，最大載荷、彈性模量較OVX組大鼠明顯改善，但最大載荷仍沒有恢復(fù)到假手術(shù)組水平。PRED+C組的股骨干及第二腰椎椎體最大載荷較PRED組顯著改善(P<0.01)且與SHAM組無明顯差異(P>0.05)，其他力學(xué)參數(shù)有一定改善但是無顯著性差異。

24、OVX+PRED+C組與OVX+PRED組比較，股骨干彈性應(yīng)力和椎體彈性模量有顯著改善，其他參數(shù)雖然有一定的改善但仍無顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、降鈣素減輕大鼠體重。
　　 2、降鈣素對(duì)于不同骨質(zhì)疏松癥大鼠模型以及同一模型的不同骨骼區(qū)域的骨量影響有顯著差異。降鈣素進(jìn)一步降低了去卵巢大鼠的骨量，對(duì)糖皮質(zhì)激素大鼠的骨量影響不顯著，可以部分改善去卵巢+糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的骨量丟失。
　　

25、3、降鈣素可以有效預(yù)防去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠模型、糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型和去卵巢+糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型等三種動(dòng)物模型的骨小梁丟失，同時(shí)使部分骨小梁得以重建。
　　 4、降鈣素更明顯的作用于松質(zhì)骨而不是皮質(zhì)骨。
　　 5、降鈣素可以使去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠模型、糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型和去卵巢+糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥大鼠模型等三種動(dòng)物模型的生物力學(xué)性質(zhì)得到部分改善。
　　 6、降鈣素主要是通過改

26、善骨微結(jié)構(gòu)而降低骨折率
　　 第三章：降鈣素預(yù)防骨質(zhì)疏松癥機(jī)制的初步研究
　　 目的：觀察各因素干預(yù)后成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的改變，初步探討骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的機(jī)制和降鈣素預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。
　　 方法：取左側(cè)股骨遠(yuǎn)端固定，脫鈣后制成石蠟切片，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記凋亡的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞；腹主動(dòng)脈采血處死動(dòng)物后，離心得到血清，使用酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)血清中的骨形成指標(biāo)：骨

27、特異性堿性磷酸酶、骨鈣素和血清Ⅰ型膠原C端肽。
　　 結(jié)果：
　　 1、各組成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞凋亡活性檢測(cè)表明：成骨細(xì)胞的凋亡細(xì)胞指數(shù)在其余各組均明顯高于SHAM組，干預(yù)組與對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組比較成骨細(xì)胞的凋亡細(xì)胞指數(shù)無顯著性差異。破骨細(xì)胞的凋亡細(xì)胞指數(shù)，在行卵巢切除術(shù)的各組(OVX組、OVX+PRED組、OVX+C組、OVX+PRED+C組)均明顯低于SHAM組，而PRED組、PRED+C組與SHAM組之間無明顯變化，干預(yù)

28、組與對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組在破骨細(xì)胞的凋亡細(xì)胞指數(shù)中無顯著性差異。
　　 2、各組大鼠血清鈣磷和骨代謝生化指標(biāo)的變化血清鈣離子水平(Ca)在OVX組、OVX+PRED組、OVX+C組、OVX+PRED+C組明顯低于SHAM組，OVX+PRED組也明顯低于PRED組而與OVX差異不明顯。干預(yù)組鈣離子水平明顯低于對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組。血清磷離子水平在OVX組、OVX+PRED組、OVX+C組、PRED+C組、OVX+M+C組明顯低于SHAM組，O

29、VX+PRED組也明顯低于PRED組而高于OVX組。降鈣素干預(yù)后，OVX+C組、OVX+PRED+C組磷離子水平明顯低于對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組而PRED+C組磷離子水平明顯高于PRED組。
　　 骨特異性堿性磷酸酶(Bone-specific Alkaline Phosphatase，ALP-B)在行去卵巢術(shù)的各組明顯高于SHAM組，在PRED+C組明顯低于SHAM組而PRED組與SHAM組比較則沒有明顯變化，干預(yù)組骨特異性堿性磷酸酶水

30、平明顯低于對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組。骨鈣素(Osteocalcin，BGP)水平在在行去卵巢術(shù)的各組明顯高于SHAM組，在PRED組、PRED+C組明顯低于SHAM組。OVX+PRED+C組骨鈣素水平明顯低于OVX+PRED組，而另兩組干預(yù)組與對(duì)應(yīng)的非干預(yù)組之間區(qū)別不顯著。血清Ⅰ型膠原C端肽(Serum Collagen-type-Ⅰ C-telopeptides，CTX-Ⅰ)在OVX組、OVX+PRED組、OVX+C組、PRED+C組、OVX+

31、PRED+C組均比SHAM組明顯增高。OVX+C組和SHAM+PRED+C組明顯高于對(duì)應(yīng)的非處理組，OVX+PRED+C組比OVX+PRED組有增高的趨勢(shì)，但沒有差異顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1、各種因素干預(yù)后，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)目和活性的變化趨勢(shì)不成正比。
　　 2、雌激素缺乏，使成骨細(xì)胞活性和破骨細(xì)胞活性增加，成骨細(xì)胞凋亡指數(shù)代償性升高，骨吸收過度導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素使成骨細(xì)胞活性降低，凋