大鼠卡氏肺孢子蟲DHFR和DHPS基因序列的測定與同源性分析.pdf

1、目的：分析我國重慶大鼠卡氏肺孢子蟲的二氫葉酸還原酶（DHFR）和二氫葉酸合成酶（DHPS）基因的序列特性，應(yīng)用PCR限制性片段長度多態(tài)性（PCR—RFLP）技術(shù)分析DHPS基因的變異。 方法：（1）用地塞米松磷酸鈉注射液腹股溝皮下注射的方法，用SD大鼠建立肺孢子蟲肺炎動物模型。（2）實驗分組：正常對照組（正常大鼠），陰性對照組（給磺胺藥的正常大鼠），陽性對照組（建立Pc模型未給磺胺藥的大鼠）和實驗組（建立Pc模型并用磺胺藥治療的

2、大鼠）。（3）肺組織印片六亞甲基四胺銀染色觀察卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii，Pc）包囊，肺組織切片蘇木素—伊紅（hematoxylin—eosin，HE）染色觀察其病理變化。（4）收集大鼠的肺組織，提取DNA，用PCR方法擴增卡氏肺孢子蟲的DHFR和DHPS基因，純化擴增產(chǎn)物后測序。檢索基因文庫（Gene bank，gb），進行同源性分析。（5）用AccⅠ和HaeⅢ兩神酶對DHPS基因的PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，

3、并應(yīng)用PCR—RFLP技術(shù)對其進行分析。 結(jié)果：（1）實驗組和陽性對照組大鼠全部感染Pc，正常對照組和陰性對照組未發(fā)現(xiàn)Pc。（2）實驗組和陽性對照組的Pc DHFR和DHPS基因PCR擴增均呈陽性，陰性對照組和正常對照組無擴增。實驗組和陽性對照組Pc DHFR有832個堿基，與gb[M26495]（Pc f.sp. rat）序列比較，同源性均為99%，與gb[AF322061]（Pc f.sp. rat）序列比較，同源性均為10

4、0%。實驗組大鼠Pc DHPS基因有816個堿基，與gb[U66283]（Pc f.sp。muris）、gb[U66282]（Pc f.sp. hominis）序列比較同源性分別為94%和83%。陽性對照組Pc DHPS基因序列有839個堿基，與gb[U66283]、gb[U66282]序列比較同源性分別為95%和84%。（3）通過限制性內(nèi)切酶AccⅠ和HaeⅢ酶切電泳，應(yīng)用PCR—RFLP技術(shù)分析實驗組和陽性對照組大鼠Pc DHPS基

5、因并未發(fā)現(xiàn)Ala55/Ser57位點的突變。 結(jié)論：（1）地塞米松磷酸鈉皮下注射法是一種建立SD大鼠肺孢子蟲肺炎動物模型的良好方法。（2）實驗組和陽性對照組Pc DHFR和DHPS基因的PCR擴增均呈陽性，兩個基因與Gene bank內(nèi)相應(yīng)的基因序列同源性較高。（3）PCR具有靈敏性好、分辨率高、重復(fù)性好、操作簡便、快速等優(yōu)點，適用于肺孢子蟲肺炎的分子生物學診斷。（4）進行PCR—RFLP分析后發(fā)現(xiàn)我國重慶SD大鼠源肺孢子蟲的D