非小細(xì)胞肺癌HAb18G的表達(dá)與其臨床病理特征、預(yù)后及生物學(xué)行為關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景:
　　 肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤。近50多年來，世界各國特別是工業(yè)發(fā)達(dá)國家，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。目前，綜合治療方案已使療效有所提高，但肺癌5年生存率仍不足20％，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因，因此探討與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)分子有著十分重要的意義。
　　 HAb18G是在研究肝癌過程中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的細(xì)胞表面黏附分子，經(jīng)GenBank數(shù)

2、據(jù)庫查詢，證實(shí)為CD147家族新成員，它具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、誘導(dǎo)MMPs產(chǎn)生、血管生成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)纖維化、激活糖酵解、抗腫瘤耐藥等許多重要功能和作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道HAb18G分子在肝癌、乳腺癌、前列腺癌和食管癌高表達(dá)提示患者的預(yù)后不良。盡管也有學(xué)者對(duì)CD147在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)和預(yù)后做出了分析，但對(duì)其是否能作為判斷非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的獨(dú)立因素觀點(diǎn)卻不一。那么作為CD147家族新成員，HAb18G與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系

3、如何？HAb18G除了具有CD147家族分子的一般功能作用，除此之外，有沒有其他新的作用？雖然以往學(xué)者也注意到HAb18G表達(dá)主要定位于胞膜或胞漿，但是他們忽略了這種不同的定位方式與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，且以往對(duì)HAb18G在組織中的表達(dá)多以定性研究為主，其定量特點(diǎn)如何？這些問題目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，為此我們進(jìn)行了研究。大量多研究表明MMPs是參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)的主要作用者，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)生了重要作用，而MMP-2、MMP

4、-9是與肺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶。癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移依賴新生血管的形成，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最有效的促血管生長因子。有研究表明在人肝癌細(xì)胞中HAb18G/CD147的高表達(dá)可以誘導(dǎo)MMPs分泌和活化，在乳腺癌細(xì)胞中該基因過表達(dá)可以引起MMP-9和VEGF的升高。在肺癌組織中，有研究表明CD147與MMP-2在蛋白水平呈正相關(guān)。那么在肺癌細(xì)胞中HAb18G與MMP-2、MMP-9和VEGF在mRNA水平是否也遵循

5、相似的規(guī)律？HAb18G作為一種新的基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑其對(duì)肺癌周圍成纖維細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9有無影響？此外，HAb18G對(duì)肺癌細(xì)胞A549生物學(xué)行為如遷移、增值和凋亡能力有何影響？這些都是有待探討的問題。
　　 本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTEN（10號(hào)染色體丟失的磷酸酶基因及張力蛋白同源物，Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）蛋白表達(dá)的缺失

6、與肺癌發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。那么PTEN與HAb18G在非小細(xì)胞肺癌中有無相關(guān)關(guān)系呢，這也是本課題研究的內(nèi)容之一。
　　 基于以上分析，本課題主要從定量和半定量角度，結(jié)合HAb18G在非小細(xì)胞肺癌中的定位情況揭示其在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特點(diǎn)及變化規(guī)律，分析其在非小細(xì)胞肺癌中的預(yù)后意義，并結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)分析PTEN和HAb18G在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)規(guī)律并探討二者相互關(guān)系。此外，我們利用RNA干擾技術(shù)，探討HAb18G與M

7、MPs和VEGF的關(guān)系，從細(xì)胞水平進(jìn)一步探討HAb18G對(duì)肺癌細(xì)胞遷移、增值、凋亡的影響。
　　 目的:
　　 1.結(jié)合HAb18G在非小細(xì)胞肺癌中的定位情況，定量分析其在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)特點(diǎn)及變化規(guī)律，并分析其在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中的意義;
　　 2.結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析PTEN與HAb18G在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)關(guān)系;
　　 3.初步探討HAb18G對(duì)其下游基因MMP-2、MMP-9及VEGF的

8、影響;初步探討HAb18G對(duì)肺癌細(xì)胞A549和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的影響;
　　 4.初步探討HAb18G對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移、增值和凋亡能力的影響。
　　 材料和方法:
　　 1.HAb18G在正常肺組織、非良性病變及非小細(xì)胞肺癌中的定量表達(dá)特點(diǎn)及其與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系
　　 用免疫組織化學(xué)SP方法檢測(cè)HAb18G蛋白在41例相對(duì)正常成人肺組織、19例肺部良性病變和208例非小細(xì)胞肺癌的表

9、達(dá)，用Imageproplus圖像分析技術(shù)測(cè)試HAb18G蛋白的陽性單位(Positive Unit，PU)，分析不同類型肺組織中HAb18G蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化規(guī)律，及其表達(dá)高低水平和不同定位情況分別與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 2.半定量結(jié)果的判斷
　　 采用半定量判斷對(duì)有隨訪資料的136例病人進(jìn)行生存分析。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分，半定量判定:陰性（無陽性著色）或弱陽性（+或者++，細(xì)

10、胞著色范圍＜30％）判斷為低表達(dá);中等強(qiáng)度陽性（++，細(xì)胞著色范圍≧30％或者+++，細(xì)胞著色范圍＜50％）或者強(qiáng)陽性(+++，細(xì)胞著色范圍＞50％)判斷為高表達(dá)。
　　 3.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitive real time PCR，qRT-PCR)方法、免疫組化檢測(cè)肺癌細(xì)胞HAb18G的表達(dá)情況，選擇表達(dá)較高者進(jìn)行RNA干擾。
　　 4.用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)SiRNA干擾HAb

11、18G后其下游基因MMP-2、MMP-9和VEGF的變化。
　　 5.用qRT-PCR檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后MMP-2和MMP-9的變化。
　　 6.劃痕實(shí)驗(yàn)、MTT增值實(shí)驗(yàn)和TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HAb18G對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 7.統(tǒng)計(jì)分析
　　 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本均數(shù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，配對(duì)樣本均數(shù)間的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。多樣本均

12、數(shù)間的比較采用方差分析，若方差齊，組間多重比較采用LSD;若方差不齊，組間的多重比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。非雙變量正態(tài)分布資料的相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)法。五年生存率的比較采用Pearson x2檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用log rank檢驗(yàn)，多因素生存分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型方法分析。
　　 結(jié)果:
　　 一、HAb18G蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

13、情況
　　 HAb18G在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)主要定位于肺癌細(xì)胞膜或漿，為粗細(xì)不等的棕褐色顆粒，其在肺鱗癌角化珠中低表達(dá)或不表達(dá);其在正常肺組織及肺良性病變中幾乎不表達(dá)，在支氣管擴(kuò)張的粘膜上皮細(xì)胞及管壁腺體上皮細(xì)胞中有少量表達(dá)。在208非小細(xì)胞肺癌患者中，35例低表達(dá)(16.8％)，173例高表達(dá)(83.2％);94例膜表達(dá)為主(45.2％)，包括51例鱗癌，33例腺癌，10例大細(xì)胞癌;81例漿表達(dá)為主(51.0％)，包括3

14、9例鱗癌，62例腺癌和5例大細(xì)胞癌;8(3.8％)例無陽性著色，包括7例腺癌和1例大細(xì)胞癌。
　　 非小細(xì)胞肺癌組織中HAb18G的PU值高于正常肺組織和肺良性病變中的PU值（t=-25.34，P=0.000）;正常肺組織和肺良性病變中的PU值基本相同（t=-1.43，P=0.158）;在208例不同組織類型的非小細(xì)胞肺癌中，PU值存在差異（F=8.51，P=0.000），其中肺鱗癌PU值大于肺腺癌(P=0.000)，肺鱗癌和肺

15、大細(xì)胞癌、肺腺癌和肺大細(xì)胞癌中HAb18G蛋白PU值基本相同，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.407和P=0.171)。
　　 在200例有著色的HAb18G蛋白定位情況中，膜表達(dá)的HAb18G蛋白PU值高于漿表達(dá)的PU值(t=8.76，P=0.000)。在膜表達(dá)組別中，不同類型的非小細(xì)胞肺癌組織中PU值存在差異（F=4.08，P=0.02），其中鱗癌的PU值分別高于腺癌和大細(xì)胞癌的PU值（P=0.025和P=0.027），腺癌和大

16、細(xì)胞癌的PU值無顯著性差異（P=0.464）;在漿表達(dá)組別中，鱗癌，腺癌和大細(xì)胞癌PU值無顯著性差異（F=5.23，P=0.085）。
　　 二、HAb18G在不同腺癌亞型中表達(dá)情況
　　 HAb18GPU值與不同的肺腺癌亞型有關(guān)（F=34.45，P=0.000），其在在貼壁為主型、乳頭為主型、腺泡為主型、微乳頭型、實(shí)體為主伴粘液形成型腺癌中表達(dá)依次升高。
　　 三、HAb18G表達(dá)水平和定位情況與非小細(xì)胞肺癌患

17、者臨床病理特征的關(guān)系
　　 在該蛋白表達(dá)水平方面，中至低分化肺鱗癌和肺腺癌癌HAb18G蛋白PU值明顯高于高分化癌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.26，P=0.000）;肺癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ-Ⅲ期、Ⅳ期HAb18G蛋白PU值依次升高，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.47，P=0.000);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌原發(fā)灶中HAb18G蛋白的PU值高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.45，P=0.015）;原發(fā)灶

18、HAb18G蛋白PU值與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶基本相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.34，P=0.74);該蛋白有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶表達(dá)水平大于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之原發(fā)灶(t=-5.58，P=0.000);男性患者HAb18G PU值的水平高于女性患者(t=2.21，P=0.028);腫瘤最大直徑＞5cm的肺癌組織PU值大于腫瘤最大直徑≦5cm的肺癌組織(t=-4.44，P=0.000);有吸煙史的患者高于無吸煙史的患者(t=-2.71，P=0.007);中

19、央型肺癌高于周圍型（t=3.88，P=0.000）。HAb18G PU值與非小細(xì)胞肺癌患者年齡無關(guān)（t=1.08, P=0.280）。
　　 200例有著色的HAb18G蛋白定位情況與臨床病理特征關(guān)系的分析結(jié)果顯示，膜表達(dá)組別中，HAb18GPU值與分化程度有關(guān)(t=-3.26，P=0.002);胞漿和胞膜的表達(dá)水平均與腫瘤的分期（分別t=5.79，P=0.004; t=7.72，P=0.000）和遠(yuǎn)處是否轉(zhuǎn)移有關(guān)（分別t=-2

20、.71，P=0.014; t=-3.46，P=0.001）。該蛋白的定位均與患者的其他臨床病理特征無關(guān)（P＞0.05）。
　　 四、HAb18G表達(dá)水平和定位情況與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系
　　 本研究中136例非小細(xì)胞肺癌患者的5年總體生存率為30.9％(42/136)。HAb18G低表達(dá)和高表達(dá)的五年生存率分別為75％(18/24)和21.4％(24/112)(x2=26.57，P=0.000)。Kaplan-Me

21、ier分析結(jié)果顯示136例非小細(xì)胞肺癌中HAb18G高表達(dá)患者的總體生存情況顯著低于HAb18G低表達(dá)患者（P=0.000，log rank檢驗(yàn)）。HAb18G在鱗癌和腺癌中表達(dá)越高，患者的生存時(shí)間也越短（分別P=0.001，P=0.003，log rank檢驗(yàn)）。在TNMⅠ和TNMⅡ-Ⅲ，HAb18G表達(dá)越高，提示患者預(yù)后越差（分別P=0.001，P=0.01，log rank檢驗(yàn)）。
　　 HAb18G在無著色組、漿定位、膜

22、定位組別中，患者五年生存率分別為85.7％(6/7),45.2％(33/73)和5.4％(3/56)，三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=33.97，P=0.000)。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示136例非小細(xì)胞肺癌中HAb18G胞膜表達(dá)患者的總體生存時(shí)間顯著低于胞漿表達(dá)（P=0.000，log rank檢驗(yàn)）。此外，無論是鱗癌還是肺腺癌中，HAb18G胞膜表達(dá)患者的總體生存時(shí)間均顯著低于胞漿表達(dá)的總體生存時(shí)間（分別P=0.000

23、，P=0.004，log rank檢驗(yàn)）。
　　 五、Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型多因素分析
　　 將患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、大體類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、HAb18G的表達(dá)及定位全變量做Cox模型多因素分析，結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HAb18G表達(dá)和定位情況是均是影響總體生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素（分別P=0.019，P=0.000，P=0.000，P=0.003）。最終選擇的四個(gè)變量模型結(jié)果

24、提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HAb18G表達(dá)和定位情況是均是影響患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素（分別P=0.012，P=0.000，P=0.000, P=0.001）。
　　 六、HAb18G受試者工作特征曲線(ROC)
　　 HAb18G的ROC曲線的面積為0.989，HAb18G蛋白PU值用于區(qū)別非小細(xì)胞肺癌與非肺癌肺組織有顯著性意義（P=0.000）。
　　 七、PTEN和HAb18G在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及

25、其相關(guān)性分析
　　 PTEN蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的陽性強(qiáng)度明顯低于肺部良性病變和正常肺組織（t=4.67，P=0.000），其表達(dá)水平與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無關(guān)（P＞0.05），周圍型大于中央型（t=2.46，P=0.016）。HAb18G蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的陽性強(qiáng)度明顯高于肺良性病變和正常肺組織(t=-17.37, P=0.000)，其表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均

26、有關(guān)（P＜0.05）。不同類型的肺組織中PTEN和HAb18G蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.312，P=0.002）。
　　 八、HAb18G對(duì)腫瘤細(xì)胞本身分泌MMP-2、MMP-9和VEGF的影響
　　 與空白對(duì)照組相比，qRT-PCR結(jié)果顯示，HAb18G SiRNA干擾48小時(shí)后其mRNA下降了94％（t=-92.96，P=0.000），空白對(duì)照組、空脂質(zhì)體組和無關(guān)序列組其HAb18G mRNA水平無顯著性差異（

27、F=0.511，P=0.610）;MMP-2 mRNA水平較對(duì)照組下降約62％（t=-10.92，P=0.000）;MMP-9mRNA水平較對(duì)照組下降70％（t=-7.27, P=0.000）;VEGF mRNA水平較對(duì)照組下降約94％（t=-45.32, P=0.000）。Western blot結(jié)果顯示SiRNA干擾48h后，HAb18G蛋白水平較對(duì)照組下降40％（t=58.55, P=0.000），MMP-2蛋白水平較對(duì)照組下降3

28、4％(t=27.23，P=0.000)MMP-9蛋白水平較對(duì)照組下降31％（t=28.64，P=0.000），VEGF蛋白水平較對(duì)照組下降35％(t=27.25，P=0.000)。
　　 九、HAb18G對(duì)肺癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后的影響
　　 對(duì)照組A549細(xì)胞和SiHAb18G A549細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后所分泌的MMP-2分別較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)增高56％(t=-174.20，P=0.000)和77.36％(t=-4

29、26.03，P=0.000);對(duì)照組A549細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后較SiHAb18G A549細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)所分泌的MMP-2增高約57％(t=-178.16，P=0.000);對(duì)照組A549細(xì)胞和SiHAb18G A549細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后所分泌的MMP-9分別較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)增高79％（t=-199.16，P=0.000）和91.67％（t=-311.81，P=0.000）;對(duì)照組A549細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后較SiH

30、Ab18G A549細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)所分泌的MMP-9增高約40％(t=-71.39，P=0.000)。
　　 十、HAb18G對(duì)肺癌細(xì)胞遷移、增值和凋亡能力的影響
　　 在劃痕后的第0h-48h動(dòng)態(tài)記錄觀察不同處理組A549細(xì)胞的遷移情況，24h結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，干擾組的A549細(xì)胞遷移距離和數(shù)量開始下降。與對(duì)照組相比，48h后干擾組的A549細(xì)胞遷移距離和數(shù)量開始明顯下降，干擾組遷移距離小于無關(guān)序列對(duì)

31、照組（t=11.39，P=0.000），干擾組細(xì)胞遷移數(shù)目小于無關(guān)序列對(duì)照組（t=36.22，P=0.000）。
　　 MTT結(jié)果顯示，干擾組A549細(xì)胞增殖能力在24h、48h和72h較空白對(duì)照組分別下降了40.15％，44.32％，42.52％(P＜0.05)，干擾組A549細(xì)胞增殖能力在24h、48h和72h較陰性對(duì)照組分別下降了41.00％，43.72％，41.98％(P＜0.05)?？瞻讓?duì)照組和無關(guān)序列組增殖能力均基本

32、相同（P＞0.05）。Ki67蛋白水平在干擾組中也顯著下降（t=17.14.P=0.000）。
　　 Tunel凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，干擾組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多，對(duì)兩組凋亡圖片進(jìn)行圖像分析，干擾組凋亡強(qiáng)度，即光密度OD值顯著高于對(duì)照組凋亡強(qiáng)度（t=-8.85，P=0.000）。
　　 結(jié)論:
　　 1.HAb18G表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者的性別、吸煙史、腫瘤直徑大小、分化、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，

33、其表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差。膜定位的HAb18G表達(dá)與分化有關(guān);膜定位和漿定位的HAb18G表達(dá)均與TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān);HAb18G細(xì)胞膜表達(dá)提示患者預(yù)后較差。Cox多因素回歸模型分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀況、HAb18G表達(dá)水平和細(xì)胞定位是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。ROC曲線提示HAb18G蛋白PU值用于診斷非小細(xì)胞肺癌有較高的價(jià)值。
　　 2.HAb18G與PTEN呈負(fù)相關(guān)，PTEN的低表達(dá)或缺失，可能與