dTMP活性肽的篩選及其對放射損傷小鼠血小板減少癥的救治作用研究.pdf

1、血小板由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生,不僅具有凝血、止血功能,而且還參與機(jī)體抗感染、血管及組織修復(fù)等重要病理生理過程。骨髓為輻射敏感器官,當(dāng)人員暴露于電離輻射后,骨髓造血干細(xì)胞的增殖與分化活性受到抑制,從而引起體內(nèi)巨核細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少,導(dǎo)致外周血血小板水平低下,易發(fā)生惡性出血、感染甚至危及生命。此外,臨床上原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥也頗為常見,如特發(fā)性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及惡性腫瘤化/放療等也可導(dǎo)致血小板減少癥的發(fā)生。促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖

2、分化,加速血小板的生成是提高外周血血小板水平、有效救治血小板減少癥的關(guān)鍵所在。然而,目前臨床上針對血小板減少癥的特效藥物和救治手段較為缺乏,并且還存在著毒副反應(yīng)突出、治療費(fèi)用高昂等諸多缺陷。所以,探尋高效促血小板生成藥物并對其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究具有重要意義。
　　促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO),又稱巨核細(xì)胞生長及發(fā)育因子(megakaryocyte growth and development facto

3、r, MGDF),共由332個(gè)氨基酸組成,能夠與巨核細(xì)胞表面相應(yīng)的受體c-Mpl結(jié)合,從而刺激巨核系祖細(xì)胞/巨核細(xì)胞的增殖與成熟分化,并最終促進(jìn)血小板的產(chǎn)生與釋放。TPO是目前已知的巨核細(xì)胞及血小板系統(tǒng)最主要、作用最強(qiáng)的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。但是,通過基因工程制備并經(jīng)聚乙二醇修飾的第一代巨核系生長因子類基因工程藥物(rhTPO和rhMGDF)因在臨床試驗(yàn)過程中誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對TPO的中和性抗體,造成自身內(nèi)源性TPO活性受抑,從而導(dǎo)致血小板數(shù)量進(jìn)

4、一步減少。因此,美國食品與藥品管理局(FDA)至今未批準(zhǔn)rhTPO類藥物進(jìn)入臨床。目前國外研究機(jī)構(gòu)已基本停止了對重組人TPO的藥用研發(fā),轉(zhuǎn)而探尋TPO類似物或其它模擬物。
　　Cwirla等學(xué)者于1997年運(yùn)用噬菌體表面展示技術(shù)篩選到了一種與天然TPO生物學(xué)特性相似而又與TPO無序列同源性的短肽(僅由14個(gè)氨基酸構(gòu)成),命名為促血小板生成素模擬肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。研究證實(shí),

5、TMP與巨核細(xì)胞表面TPO受體(c-Mpl)具有較高的親和能力,可促進(jìn)依賴TPO細(xì)胞株的增殖和分化,而且由于與天然TPO無相同氨基酸序列,所以不會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TPO中和性抗體。但是,由于其促血小板生成活性相對較弱,且在機(jī)體內(nèi)半衰期較短,導(dǎo)致其推廣應(yīng)用受到極大限制。
　　研究發(fā)現(xiàn),TPO之所以具有突出的促巨核細(xì)胞增殖、分化和升血小板活性,是因?yàn)樗軌蛲瑫r(shí)結(jié)合兩個(gè)配對的c-Mpl分子,而也只有當(dāng)c-Mpl分子形成二聚體后才能激活胞內(nèi)有

6、關(guān)增殖、分化的信號(hào)通路。由于一個(gè)TMP單體肽只能結(jié)合一個(gè)c-Mpl分子,所以盡管其與c-Mpl分子具有較高的親和力,但是其促巨核細(xì)胞增殖、分化的活性并不突出。如果將兩條TMP單鏈連接形成TMP二聯(lián)體(dTMP),一個(gè)dTMP多肽則可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)配對的c-Mpl分子,從而顯著提高其促血小板生成活性。
　　有研究報(bào)道,促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)的模擬肽 EMP1與同源肽EMP33均可與受體EPOR結(jié)合,

7、但是EMP33并不能激活EPOR下游的JAK-STAT信號(hào)通路,原因在于EMP1和EPOR的復(fù)合體與EMP33和EPOR的復(fù)合體的旋轉(zhuǎn)角度不同(相差約15度)。有研究提示兩個(gè)EMP1之間的連接肽可以調(diào)節(jié)兩個(gè)EMP1的角度,所以選擇合適的連接肽對于提高EMP1二聚體的活性至關(guān)重要。同理,兩個(gè) TMP之間連接肽的選擇也會(huì)對dTMP與c-Mpl的結(jié)合及其促血小板生成活性產(chǎn)生顯著影響。
　　因此,為了尋找具有突出升血小板活性的dTMP線性

8、多肽,在本研究中我們首先設(shè)計(jì)并合成了一系列由不同連接肽將兩個(gè) TMP頭尾串聯(lián)起來的 dTMP多肽,從長度及氨基酸組成兩個(gè)層面對連接肽進(jìn)行篩選。然后,從激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的角度探討dTMP優(yōu)選肽促巨核細(xì)胞增殖分化的作用機(jī)制,同時(shí),結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬及分子對接軟件對dTMP的三維結(jié)構(gòu)及其與受體c-Mpl的結(jié)合方式進(jìn)行分析。最后,復(fù)制急性放射損傷小鼠血小板減少癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,觀察dTMP優(yōu)選肽對放射損傷所致小鼠血小板減少的救治作用。所獲得

9、的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.連接肽長度對dTMP的促巨核細(xì)胞增殖活性具有顯著影響,其中由8個(gè)G(甘氨酸)作為連接肽的dTMP活性較為突出。
　　2.通過對連接肽的氨基酸組成進(jìn)行調(diào)整,發(fā)現(xiàn)在連接肽結(jié)構(gòu)中加入脯氨酸(Proline, P)可顯著提升dTMP的促巨核細(xì)胞增殖活性。
　　3.通過兩輪篩選最終獲得與等摩爾 TPO具有相似活性的 dTMP優(yōu)選肽(命名為No.341多肽)。
　　4.小鼠骨髓原代巨核細(xì)胞

10、檢測結(jié)果顯示,經(jīng) No.341多肽刺激培養(yǎng)14天,小鼠Sca+-I細(xì)胞表面CD41/CD61(巨核細(xì)胞成熟標(biāo)志物)的表達(dá)水平較IL-3對照組顯著增高(83.26±6.26％vs15.70±2.31%, P<0.01),進(jìn)一步證實(shí)該TMP二聯(lián)肽具有顯著促巨核細(xì)胞成熟、分化的作用。
　　5. Western blot結(jié)果顯示,dTMP(No.341多肽)作用10min即可顯著上調(diào)M07e細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT5及ERK1/2的磷酸化水

11、平。另一方面,給予JAK-STAT和ERK信號(hào)通路阻斷劑則可以顯著抑制 No.341多肽的促巨核細(xì)胞增殖作用,提示 dTMP生物活性的發(fā)揮與其能夠快速激活 STAT5和ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。
　　6.分子動(dòng)力學(xué)模擬及分子對接分析結(jié)果表明,連接肽的長度和氨基酸組成可以顯著影響dTMP的空間構(gòu)象,包括兩條 TMP單鏈之間的角度、跨度以及活性位點(diǎn)的暴露等,并能決定 dTMP與 c-Mpl的分子對接方式,在一定程度上揭示了連接肽影響d