GH促血小板生成機制分析及dTMP-GH對輻射損傷小鼠的救治作用研究.pdf

1、隨著電離輻射在軍事、經濟、農業(yè)生產、醫(yī)療衛(wèi)生等領域中的不斷應用,由電離輻射引起的各種損傷也在逐漸增加。骨髓是輻射敏感組織之一,當機體受到全身或局部一定劑量射線照射后,即可引起骨髓造血功能障礙,表現為白細胞、紅細胞、血小板等全血細胞急劇減少,其中血小板生成減少和功能障礙是引起機體出血、感染的重要原因,也是影響機體存活和疾病預后的主要因素之一[1]。因此,促進外周血血小板水平的快速恢復是治療輻射損傷的一個關鍵環(huán)節(jié)。目前臨床上治療血小板減少癥

2、的藥物種類較少,而且大部分還存在著起效慢、副作用明顯等缺點。所以,尋找和研制高效、低毒的新型升血小板藥物成為一個人們迫切關注的問題。
　　血小板來源于骨髓巨核細胞,而巨核細胞又是經造血干細胞分化而成,因此,巨核細胞的分化過程會直接影響血小板的產生時間和產量[2]。血小板生成素(thrombopoietin, TPO)是調節(jié)巨核細胞增殖、分化和血小板生成最重要的細胞因子。TPO與其受體c-Mpl結合后,激活相應信號通路,從而刺激巨核

3、細胞的增殖、分化和血小板生成[3]。但是有文獻報道,一些重度血小板減少癥患者在使用重組人TPO(rhTPO)后5天左右時間外周血血小板水平才開始升高,到12天達到峰值,正因如此,患者處于血小板危象期的時間并沒有得到顯著縮短[4][5]。導致血小板延遲升高的原因可能與TPO不能促進巨核細胞終末分化(包括血小板前體形成和血小板釋放)有關。更重要的是,由于能夠誘導體內產生TPO中和性抗體[6][7],美國FDA禁止了有關重組TPO基因工程藥物

4、的研發(fā)?；诖?人們轉而尋找和研制TPO的類似物和模擬物。TPO模擬肽(thrombopoietin mimetic peptide, TMP)的發(fā)現引起了人們的充分關注[1],雖然它僅含14個氨基酸,但其二聚體或二聯體多肽與TPO一樣都可以結合并激活TPO的受體c-Mpl,顯示出較強的促巨核細胞增殖與分化活性[2][3]。但是,無論是TMP二聚體還是二聯體多肽的分子量都比較小,體內半衰期相對較短,使其體內應用受到限制。
　　研究

5、證實,生長激素(growth hormone, GH)通過與其受體GHR結合,能夠促進不同種類細胞的增殖和/或分化[4]。有研究發(fā)現體內缺乏GH的DW/J侏儒小鼠外周血數量(包括有白細胞,紅細胞以及血小板)顯著降低[5]。隨后有報道指出,給予放/化療或骨髓移植小鼠大劑量的GH能夠顯著促進小鼠骨髓造血功能重建,包括血小板水平的快速恢復[6][7][8][9][10]。另外,近來一項臨床研究結果表明,接受化療藥物強化治療的血液腫瘤患者在使用

6、大劑量GH后其外周血小板水平能提前3天左右時間恢復[11]。所有的這些數據都提示GH可能在血小板生成過程中發(fā)揮了重要的調控作用,但其具體作用于血小板生成的哪個階段及相關機制尚不清楚。
　　1.采用免疫磁珠分離、流式細胞分析、免疫熒光、電鏡觀察、Western blot和CCK-8本研究首先分析了GH和一種血小板生成素模擬肽二聯體(dTMP)分別對巨核細胞增殖分化、血小板前體形成以及血小板產生的調控作用及可能機制。研究發(fā)現 dTMP

7、主要作用于巨核細胞增殖分化的早期階段,而GH則主要作用于巨核細胞的終末分化階段,二者聯合具有協(xié)調促血小板生成的作用。在此基礎上,將GH與dTMP進行融合,通過體外實驗對dTMP-GH融合蛋白的促血小板生成作用進行驗證,進而探討了dTMP-GH融合蛋白對輻射損傷所致小鼠血小板減少的救治作用。所取得的主要研究結果與結論如下:
　　等方法,建立了人臍血來源巨核細胞原代培養(yǎng)、巨核細胞增殖分化、血小板前體形成和血小板產生等一套完整的血小板生

8、成檢測與分析技術體系。
　　2.體外研究結果表明,GH不能促進巨核祖細胞的增殖,但具有促進巨核細胞分化的作用。
　　3.GH能夠以劑量依賴方式促進晚期巨核細胞形成血小板前體和產生血小板,提示GH具有促進巨核細胞終末分化的作用。
　　4.對于早期巨核祖細胞,GH不能激活STAT5信號通路,但能延遲和持續(xù)激活ERK1/2信號通路,給予ERK1/2信號通路阻斷劑能夠抑制GH的促巨核細胞分化作用,提示GH的促巨核細胞分化作用與

9、其激活ERK1/2的方式有關。
　　5.對于晚期成熟巨核細胞,GH具有快速激活Akt信號通路的作用,并且能夠增強Rho激酶Cdc42和Rac1的活性,給予Akt和Rho信號通路阻斷劑可以抑制GH的促血小板前體形成和血小板生成作用,提示GH通過激活Akt/Rho信號通路而發(fā)揮促進巨核細胞終末分化的功能。
　　6.體外實驗證實dTMP能夠以劑量依賴方式促進巨核祖細胞的增殖與分化,但對血小板前體形成和產板卻具有抑制作用,說明dTM

10、P主要通過促進早期巨核細胞的增殖與分化而發(fā)揮促血小板生成作用。
　　7.與單獨dTMP相比,dTMP與GH聯合應用能顯著促進血小板前體形成、加速血小板生成與釋放,同時伴有β1-tubulin表達增強、巨核細胞內膜系統(tǒng)形成,提示GH與dTMP在血小板生成方面具有互補作用。
　　8.dTMP-GH融合蛋白可以顯著促進巨核細胞增殖與分化,且其作用顯著優(yōu)于單純dTMP以及dTMP+GH處理組,提示通過與GH融合可以提高dTMP的促巨

11、核細胞增殖分化能力,其機制可能與蛋白空間構象改變或受體介導信號通路的交叉激活有關。
　　9.dTMP-GH融合蛋白能夠顯著上調巨核細胞GATA-1、NF-E2及β1-tubulin的表達;與單純 dTMP處理組相比,dTMP-GH融合蛋白處理組血小板前體形成和血小板產生時間提前,數量增多。
　　10.Western blot結果表明,dTMP-GH不僅能夠快速激活巨核祖細胞中STAT5信號通路,而且還能持續(xù)活化ERK1/2信

12、號通路,同時還具有激活晚期巨核細胞Akt的能力,從信號通路激活角度進一步證實dTMP-GH同時具有促進早期巨核細胞增殖分化和晚期巨核細胞成熟和產板的活性。
　　11.成功復制急性輻射損傷小鼠血小板減少癥動物模型,與生理鹽水對照組和dTMP處理組相比,給予dTMP-GH融合蛋白處理能夠加速受照小鼠血小板水平恢復,顯著升高受照小鼠外周血小板最低值水平,縮短血小板處于低谷期時間,并顯著提高小鼠存活率,提示dTMP-GH對急性輻射損傷所致

13、血小板減少具有突出的救治作用。
　　12.dTMP-GH融合蛋白對卡鉑化療及放療聯合化療所致小鼠血小板減少也具有顯著的救治作用,不僅可以促進血小板水平快速恢復,而且還可顯著降低小鼠死亡率。
　　總之,通過本實驗研究我們首次發(fā)現GH具有促進巨核細胞終末分化、加速血小板前體形成和血小板產生的作用,并初步闡明了其作用機理;同時,發(fā)現GH與dTMP具有協(xié)同促血小板生成的作用,并證實dTMP-GH重組融合蛋白同時具有促進早期巨核細胞增