雌激素對放射損傷血小板減少癥的救治作用及機制研究.pdf

1、隨著科技的發(fā)展，核能及其相關(guān)的技術(shù)在軍事、醫(yī)學、工業(yè)等多個領(lǐng)域得到了更加廣泛的應用。然而，核能為我們的生活帶來便利的同時，也增加了由電離輻射引起放射損傷的潛在風險。尤其是核事故、核爆炸等情況下會產(chǎn)生大量的放射損傷傷員。此外，臨床上接受放射治療和骨髓移植的腫瘤患者也會受到一定程度的放射損傷。骨髓是放射損傷的主要靶器官。其中，放射損傷引起的血小板嚴重減少會導致機體出血和感染，甚至死亡。不幸的是，目前臨床上血小板減少癥的治療藥物種類較少，而且

2、它們大多還存在著起效慢、副作用大、價格昂貴等缺點。因此，尋找一種有效、安全的放射損傷血小板減少癥的預防和救治方法顯得至關(guān)重要。
　　血小板由骨髓中的巨核細胞產(chǎn)生，血小板生成過程主要包括造血干細胞定向分化為巨核祖細胞、巨核祖細胞大量擴增并分化為成熟巨核細胞、成熟巨核細胞釋放血小板等多個階段。其中巨核細胞的分化成熟是血小板產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。巨核細胞成熟首先進行核內(nèi)有絲分裂以形成多倍體，然后巨核細胞進入一個胞質(zhì)成熟過程，即脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大量

3、合成并形成分界膜系統(tǒng)，最后巨核細胞向血管竇伸出血小板前體并向血液循環(huán)中釋放血小板。在體內(nèi)，調(diào)控血小板生成最重要的細胞因子是血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)。但是，我們及他人的研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)還有其他因子也參與了血小板生成的調(diào)控。
　　雌激素是哺乳動物體內(nèi)非常重要的一種性激素，主要由卵巢產(chǎn)生和分泌，它在人體內(nèi)有著廣泛的生物學作用。多個研究報道，雌激素對造血系統(tǒng)也有影響作用。有趣的是，巨核細胞不但被證實自身能產(chǎn)生雌激素

4、，而且雌激素和巨核細胞生成和血小板生成有一定的聯(lián)系。大量的臨床數(shù)據(jù)表明人體血小板水平也存在性別差異，而且這種性別差異與體內(nèi)的雌激素水平有關(guān)。另外，大量的研究表明，雌激素不僅在體外能夠促進巨核細胞分化及血小板前體形成，在體內(nèi)也可促進血小板的產(chǎn)生，但是使用他莫昔芬或氟維司群抑制雌激素受體(estrogen receptor，ER)的激活則會抑制血小板的產(chǎn)生。這些研究表明雌激素參與了巨核細胞的生成和血小板的產(chǎn)生，但是雌激素作用于血小板生成的哪

5、一階段及其相關(guān)機制仍未完全闡明。
　　雌激素是一種類固醇激素，主要通過雌激素受體ERα和ERβ發(fā)揮作用。ERα和ERβ是一類核受體，未激活時，ER位于細胞膜上，與配體雌激素結(jié)合后激活，從而形成同源二聚體（ERα/ERα或ERβ/ERβ）或異源二聚體(ERα/ERβ)，然后由細胞膜移位到細胞核中，與靶基因啟動子上游的雌激素反應元件(estrogen response element，ERE)結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的表達，從而發(fā)揮其生物學效

6、應。ERα和ERβ在全身表現(xiàn)為明顯的組織特異性分布。ERα主要表達于性器官如卵巢、乳腺等，而ERβ主要表達于非性腺器官如骨髓、肺、結(jié)腸等。另外，ERα和ERβ在結(jié)構(gòu)及功能如配體識別和結(jié)合、受體激活、輔活化子或輔阻遏物的募集、靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上也有明顯的差異。已有研究報道，巨核細胞均表達ERα和ERβ，但是，哪種受體在雌激素對巨核細胞的作用中發(fā)揮主要作用及其下游的靶分子和信號轉(zhuǎn)導通路仍有待證實。
　　另一方面，雌激素是一種經(jīng)典的抗放藥

7、物，在動物實驗中都被證實有輻射保護作用，無論照前給藥還是照后給藥都可以顯著提高存活率。同樣在放療病人照射前給予雌激素，可以減輕外周血白細胞下降的程度，但是雌激素能否用于預防和治療放射損傷血小板減少癥仍然缺乏相關(guān)的研究。
　　圍繞以上科學問題，本研究使用小鼠骨髓(bone marrow，BM) Sca1+細胞來源的原代巨核細胞、人臍帶血(cord blood，CB) CD34+細胞來源的原代巨核細胞、人巨核祖細胞株M07e細胞、人成

8、熟巨核細胞株Meg-01細胞及c-Mpl-/-和ERβ-/-敲除小鼠，首先利用正常的C57BL/6J小鼠建立亞致死量放射損傷血小板減少癥模型，并在照射前或照射后給予雌激素處理，觀察雌激素對血小板水平恢復的影響;再利用細胞活性分析、流式細胞術(shù)、細胞免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察和血常規(guī)檢測等技術(shù)分析雌激素對巨核細胞增殖、分化、多倍體形成、血小板前體形成及血小板產(chǎn)生的影響，以明確雌激素對血小板生成的調(diào)控作用及作用階段;最后，再利用weste

9、rn blot、RT-PCR、qRT-PCR、小干擾RNA(siRNA)基因敲低、雙熒光素酶報告系統(tǒng)、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等方法，對雌激素促血小板生成作用的分子機制進行深入分析。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、通過建立小鼠急性放射損傷模型發(fā)現(xiàn)，急性放射損傷可導致小鼠血小板水平快速降低，而放射前雌激素預處理或放射后雌激素干預均能有效加速放射后小鼠血小板水平的恢復，縮短放射后血小板低谷期的持續(xù)時間，并顯著提高受照后小鼠的生存

10、率。說明傳統(tǒng)抗輻射藥物不但可以預防放射損傷血小板減少癥，還對放射損傷血小板減少癥有一定的救治作用。
　　2、雌激素盡管不能促進巨核祖細胞的增殖，但卻可以促進巨核細胞的分化成熟、多倍體形成、血小板前體的形成和血小板的產(chǎn)生，并且可以促進小鼠骨髓巨核細胞成熟分化，顯著升高外周血血小板水平，說明雌激素可以促進巨核細胞晚期分化，從而促進血小板的生成。
　　3、雌激素處理巨核細胞可以顯著激活巨核細胞的ERβ受體，而非ERa受體，阻斷或敲

11、低ERβ可以顯著抑制雌激素誘導的巨核細胞分化成熟和多倍體形成，提示ERβ可能是雌激素促血小板生成作用的主要靶受體。
　　4、雌激素誘導巨核細胞ERβ激活后，在眾多巨核細胞重要調(diào)控分子中發(fā)現(xiàn)GATA1的表達顯著上調(diào)，而敲低ERβ幾乎完全抑制了雌激素誘導的GATA1表達上調(diào)，提示GATA1可能是雌激素下游效應的主要靶分子。進一步通過雙螢光素酶報告系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗證實ERβ可以和GATA1的啟動子結(jié)合，可能的ERE

12、序列位于-1380至-1574;另外，敲低巨核細胞GATA1的表達后，雌激素誘導巨核細胞多倍體形成效應消失。這些結(jié)果表明，GATA1是ERβ下游的靶分子，ERβ激活后可與GATA1啟動子結(jié)合，從而誘導GATA1表達上調(diào)，進而促進巨核細胞多倍體形成。
　　5、體外實驗證明，雌激素還可誘導GATA1下游靶分子STAT1表達上調(diào)和活化增強;敲低巨核細胞ERβ和GATA1的表達后，雌激素并不能誘導STAT1表達上調(diào)和活化增強;另外，敲低S

13、TAT1的表達幾乎可以完全抑制雌激素促多倍體形成的作用，提示STAT1可能是GATA1作用的下游靶分子，介導了雌激素促巨核細胞多倍體形成的作用。
　　6、NF-E2是GAT1下游的一個靶分子，體外實驗表明雌激素處理巨核細胞后可以誘導NF-E2的表達上調(diào)，而敲低GATA1則可完全抵消雌激素誘導的NF-E2表達上調(diào);另外，NF-E2是巨核細胞血小板前體形成和血小板產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)控分子，這些結(jié)果提示，NF-E2可能是GATA1作用的下游靶