hRPE細胞表達整合素α-,5-的調節(jié)機制及意義研究.pdf

1、目的: 探討表皮生長因子（EGF）對人視網膜色素上皮細胞（hRPE）表達整合素α5的調節(jié)及意義。 方法: 1）通過玻璃體切除術采集14例視網膜脫離病例的視網膜下膜標本，用免疫組化方法檢測下膜中角蛋白，整合素α5β1及纖維粘連蛋白（FN）的表達。免疫熒光雙標記法研究視網膜下膜色素上皮細胞與整合素α5β1表達的關系，熒光定量分析視網膜下膜與正常視網膜下膜組織中整合素α5β1表達的差異。 2）人視網膜色素上皮細胞原

2、代、傳代培養(yǎng)；分別用0ng/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、100 ng/ml濃度EGF誘導hRPE；RT-PCR、免疫組化和流式細胞術觀察整合素α5mRNA和蛋白的表達；MTT法檢測各實驗組細胞增生率，采用直徑為8.5mm的Boyden小室實驗進行細胞遷移能力的檢測。 3）將實驗分成對照組、10ng/mlEGF組和PD98059組，RT-PCR及流式細胞術觀察不同實驗組整合素α5

3、 mRNA和蛋白的表達；Western blot法檢測各組hRPE細胞中MAPK磷酸化水平。 結果: 1）所有14例下膜標本中整合素α5β1纖維粘連蛋白（FN）表達均呈陽性，角蛋白表達均呈陽性的細胞（即RPE細胞）的細胞膜上表達整合素α5β1，與正常視網膜組織比較表達顯著增強（P<0.05）。 2) 與0ng/ml組相比，24h后1ng/ml的EGF促進人hRPE細胞中整合素α5mRNA和蛋白的表達，并呈濃度依賴

4、性，而濃度為10～100ng/ml時促進作用達到高峰。流式細胞術檢測顯示：10ng/ml的EGF作用時熒光強度最強為3.98±0.67，0ng/ml和0.1ng/ml組分別為1.87±0.22，1.98±0.54（P<0.01）。MTT法檢測顯示：與對照組相比，EGF組及加入不相關抗體(兔抗人波形蛋白抗體)組細胞增生、遷移明顯，而加入兔抗人整合素α5多克隆抗體(1:100)組較弱，與前兩組相比差異有顯著性（P<0.01）。 3)

5、 與對照組相比，EGF促進整合素α5 mRNA和蛋白的表達，而PD98059(20 μmol/L)可抑制此促進作用；流式細胞術顯示24h后整合素α5熒光強度分別為1.94±0.22，4.56±0.25，2.39±0.14，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot結果顯示30 min 后EGF組ERK1/2磷酸化激活水平最高，PD98059組抑制ERK1/2的磷酸化激活，對照組ERK1/2的磷酸化激活作用很弱。