hRPE細(xì)胞表達(dá)整合素α-,5-的調(diào)節(jié)機(jī)制及意義研究.pdf

1、目的: 探討表皮生長(zhǎng)因子（EGF）對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（hRPE）表達(dá)整合素α5的調(diào)節(jié)及意義。 方法: 1）通過(guò)玻璃體切除術(shù)采集14例視網(wǎng)膜脫離病例的視網(wǎng)膜下膜標(biāo)本，用免疫組化方法檢測(cè)下膜中角蛋白，整合素α5β1及纖維粘連蛋白（FN）的表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)記法研究視網(wǎng)膜下膜色素上皮細(xì)胞與整合素α5β1表達(dá)的關(guān)系，熒光定量分析視網(wǎng)膜下膜與正常視網(wǎng)膜下膜組織中整合素α5β1表達(dá)的差異。 2）人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞原

2、代、傳代培養(yǎng)；分別用0ng/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、100 ng/ml濃度EGF誘導(dǎo)hRPE；RT-PCR、免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)觀察整合素α5mRNA和蛋白的表達(dá)；MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增生率，采用直徑為8.5mm的Boyden小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)。 3）將實(shí)驗(yàn)分成對(duì)照組、10ng/mlEGF組和PD98059組，RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)觀察不同實(shí)驗(yàn)組整合素α5

3、 mRNA和蛋白的表達(dá)；Western blot法檢測(cè)各組hRPE細(xì)胞中MAPK磷酸化水平。 結(jié)果: 1）所有14例下膜標(biāo)本中整合素α5β1纖維粘連蛋白（FN）表達(dá)均呈陽(yáng)性，角蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性的細(xì)胞（即RPE細(xì)胞）的細(xì)胞膜上表達(dá)整合素α5β1，與正常視網(wǎng)膜組織比較表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05）。 2) 與0ng/ml組相比，24h后1ng/ml的EGF促進(jìn)人hRPE細(xì)胞中整合素α5mRNA和蛋白的表達(dá)，并呈濃度依賴

4、性，而濃度為10～100ng/ml時(shí)促進(jìn)作用達(dá)到高峰。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：10ng/ml的EGF作用時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)為3.98±0.67，0ng/ml和0.1ng/ml組分別為1.87±0.22，1.98±0.54（P<0.01）。MTT法檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，EGF組及加入不相關(guān)抗體(兔抗人波形蛋白抗體)組細(xì)胞增生、遷移明顯，而加入兔抗人整合素α5多克隆抗體(1:100)組較弱，與前兩組相比差異有顯著性（P<0.01）。 3)

5、 與對(duì)照組相比，EGF促進(jìn)整合素α5 mRNA和蛋白的表達(dá)，而PD98059(20 μmol/L)可抑制此促進(jìn)作用；流式細(xì)胞術(shù)顯示24h后整合素α5熒光強(qiáng)度分別為1.94±0.22，4.56±0.25，2.39±0.14，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示30 min 后EGF組ERK1/2磷酸化激活水平最高，PD98059組抑制ERK1/2的磷酸化激活，對(duì)照組ERK1/2的磷酸化激活作用很弱。