整合素β1對泡沫細胞形成的影響及其機制的初步研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)及其并發(fā)癥是威脅人類健康的“第一殺手”。AS的發(fā)生是一個多種因素在多層次上綜合作用的過程。血脂水平的升高伴隨著單核細胞活化成為巨噬細胞以及大量氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)的生成，隨之巨噬細胞在一系列信號分子的介導下吞噬ox-LDL 形成泡沫細胞。泡沫細胞的形成是AS 早期變化的特征性標志，也是AS 斑塊損傷形成、

2、發(fā)展和崩解的關鍵。因此，在廣泛使用調脂抗炎藥物防治AS的同時，抑制巨噬源性泡沫細胞的形成作為AS治療的新策略日益受到重視。
　　 我室前期對AS 發(fā)生過程中差異表達基因的研究表明，整合素家族的基因包括integrin β1、integrin β2、integrin α6等均顯著上調；對AS 過程中關鍵基因篩選、鑒定及三七總皂苷(totAlsaponins of Panax notoginseng, PNS)調控作用的研究發(fā)現，整

3、合素家族表達上調作用尤為明顯，對整合素家族的調控是PNS 防治AS的關鍵環(huán)節(jié)。整合素β1(integrin β1)在AS 發(fā)生早期主要介導了單核細胞與血管內皮的黏附，但是在巨噬細胞吞噬ox-LDL 形成泡沫細胞的過程中是否發(fā)揮作用及其相關機制未見報道。為此，本課題應用RNA 干擾技術探討integrin β1對泡沫細胞形成的影響及其初步機制，為AS的防治提供新的靶標。
　　 方法：
　　 1．檢測RAW264.7細胞的轉

4、染效率：RAW264.7細胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后，分為Cy3 標記siRNA 轉染組和空白對照組。轉染組用lipo2000脂質體試劑將Cy3-siRNA 轉染到RAW264.7細胞中，空白對照組除了不加轉染試劑和siRNA 外其他操作相同。轉染8h后，置于熒光顯微鏡下綠光(G)激發(fā)，觀察細胞內的紅色熒光表達情況。
　　 2．篩選最有效的siRNA：針對integrin β1基因的不同

5、靶點設計3 條siRNA。RAW264.7細胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后，用lipo2000脂質體試劑分別將siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNANC 轉染到RAW264.7細胞中，另設空白對照組，不加任何轉染試劑，轉染試劑對照組，只加lipo2000脂質體試劑，不加siRNA。轉染24h后，應用Real-time PCR 檢測integrin β1基因mRNA表達水平。
　　

6、 3．RAW264.7細胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后分為siRNA1轉染組、siRNANC 陰性對照轉染組、空白對照組、轉染試劑對照組4組，各轉染組分別用lipo2000脂質體試劑將siRNA和siRNANC 轉染到RAW264.7細胞中，空白對照組正常培養(yǎng)，不加任何轉染試劑，轉染試劑對照組只加lipo2000脂質體試劑，不加siRNA。轉染24 h后，黏附實驗測定各組細胞的黏附率。
　　

7、 4．RAW264.7細胞用含10％ FBS的DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至30％-50％融合后分為siRNA1轉染組、siRNANC 陰性對照轉染組、空白對照組、轉染試劑對照組4組，各組處理同前。轉染6 h后，用含ox-LDL(25 mg/L)的DMEM 培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)各組細胞18h后，脂質化學染色法測定各組細胞的泡沫細胞轉化率，膽固醇氧化酶終點法測定各組細胞內的總膽固醇含量，原子力顯微鏡觀察各組細胞膜上的小凹結構，western bl

8、ot 檢測各組細胞膜上清道夫受體CD36的表達水平。
　　 結果：
　　 1．轉染效率：熒光顯微鏡下觀察轉染Cy3 標記siRNA的RAW264.7細胞中有紅色熒光表達，提示轉染試劑lipo2000能成功將siRNA 轉染到細胞中，且轉染效率可高達98％。
　　 2．最有效siRNA的篩選：3 條siRNA對integrin β1mRNA表達的沉默效率分別為65％、50％和58％。因此后續(xù)試驗選用siRNA1進行

9、。
　　 3．有效沉默RAW264.7細胞的integrin β1基因表達后，與對照組相比，其黏附功能顯著降低(P＜0.01)；ox-LDL 誘導培養(yǎng)后，siRNA 轉染組泡沫細胞轉化率明顯降低(P＜0.01)，總膽固醇顯著減少(P＜0.01)；原子力顯微鏡觀察到siRNA 轉染組的細胞膜上小凹結構減少，WB 結果顯示siRNA 轉染組CD36表達降低(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1.沉默integri