兩種佐劑對虹鱒殺鮭氣單胞菌滅活疫苗免疫效果的影響.pdf

1、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida，As)是一類重要的咸淡水養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌，主要引起鮭鱒魚類如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、金鱒（Oncorhynchus mykiss）和大西洋鮭（Salmo salar）等癤瘡病及潰瘍病，被感染魚體死亡率高影響范圍廣，并且其宿主范圍在逐年擴(kuò)大，嚴(yán)重制約了中國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。目前，中國一般采用化學(xué)藥物及各類抗生素防治殺鮭氣單胞菌，抗生素藥物的使用容易導(dǎo)致病原

2、菌出現(xiàn)交叉耐藥反應(yīng)，同時(shí)也使人類面臨環(huán)境污染及食品安全問題。疫苗是防治殺鮭氣單胞菌的最有效方法，在國外，采用接種商業(yè)化疫苗方法預(yù)防此菌感染已取得較好的保護(hù)效果。因而針對虹鱒殺鮭氣單胞菌開展免疫防控研究具有重要意義。本文選取蜂膠佐劑和弗氏完全佐劑分別添加到殺鮭氣單胞菌滅活疫苗中，然后免疫虹鱒，評價(jià)對的虹鱒相對免疫保護(hù)率，并采集虹鱒肝、脾臟、頭腎和鰓組織用于RNA的提取，分析疫苗對免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期獲得具有良好免疫效果的佐劑聯(lián)合疫

3、苗。本文主要內(nèi)容如下：
　　第一部分：從本實(shí)驗(yàn)室保藏的2014-2015年分離自大西洋鮭和虹鱒等體內(nèi)的氣單胞菌50株，結(jié)合革蘭氏染色、生化特性和分子特征對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：50株受試菌中有7株均為G-；葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、氧化酶陽性等；Blast比對分析發(fā)現(xiàn)7株菌的16S rRNA序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中殺鮭氣單胞菌的不同菌株的16S rRNA基因序列同源性較高相似性達(dá)99％以上，以殺鮭氣單胞菌的特異性基因fstA設(shè)計(jì)引物

4、再次鑒定，經(jīng)過比對分析后確定該7株菌均為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（A.salmonicida subsp.salmonicida）。血清學(xué)分析發(fā)現(xiàn)7株菌均為同一血清型。7株殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（以下均稱殺鮭氣單胞菌As）的毒力測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株NO.7毒力最強(qiáng)，死亡率達(dá)到100%，以該菌作為制備疫苗的菌株。
　　第二部分：根據(jù)GenBank中殺鮭氣單胞菌鐵載受體（ferric siderophore receptor，fstA）序列設(shè)

5、計(jì)并合成一對特異性引物，建立了檢測殺鮭氣單胞菌的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并對特異性、靈敏度和可重復(fù)性進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的引物具有良好的種間特異性，僅對殺鮭氣單胞菌及其亞種有陽性擴(kuò)增，與其他細(xì)菌不發(fā)生交叉反應(yīng)。構(gòu)建的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)?？截悢?shù)與循環(huán)閾值值線性關(guān)系良好，擴(kuò)增所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-4.2552x+39.644，相關(guān)系數(shù)R2為0.988，最低檢測限為35拷貝/μL，較常規(guī)PCR的靈敏度

6、高出約100倍。應(yīng)用建立的方法檢測人工感染的虹鱒病樣，15個(gè)被檢樣品呈陽性反應(yīng)，與細(xì)菌常規(guī)鑒定方法結(jié)果一致。研究表明，所建立的基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的殺鮭氣單胞菌定量檢測方法快速、特異、靈敏，可用于臨床診斷和疫病監(jiān)測。
　　第三部分：將蜂膠佐劑和弗氏完全佐劑分別與殺鮭氣單胞菌滅活疫苗混合均勻，制備成蜂膠佐劑疫苗和弗氏完全佐劑疫苗，此外，將蜂膠佐劑和弗氏完全佐劑分別與PBS（pH7.3）混合均勻作為對照組。注射免疫試驗(yàn)共分6組，

7、分別為A組（PBS對照組）、B組（蜂膠佐劑+滅活疫苗組）、C組（蜂膠佐劑+PBS組）、D組（滅活疫苗組）、E組（弗氏完全佐劑+滅活疫苗組）和F組（弗氏完全佐劑+PBS組）。在免疫30d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，比較各組疫苗虹鱒的相對免疫保護(hù)率，同時(shí)對免疫后不同時(shí)間段內(nèi)虹鱒各主要免疫器官（肝、鰓、頭腎和脾臟）中各免疫相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：攻毒14d后A組虹鱒死亡率為100%，B組免疫保護(hù)率最高達(dá)到90%，其次是E組為85%，都明顯

8、高于D組，這說明佐劑的加入有效提高了疫苗的保護(hù)作用。免疫后各組織中的7種基因顯著上調(diào)表達(dá)，且B和E組表達(dá)量普遍高于A組、D組和F組；四種組織中，IL-8、IL-1β、MHCⅠ、CD8和IgT5種基因的表達(dá)最大值出現(xiàn)在免疫后1-3d，IFN-γ和IgM在鰓中的表達(dá)最大值出現(xiàn)在3-7d，各基因表達(dá)量最高值為對照組的2.0-70.0倍，攻毒7d后，各組織中7種基因表現(xiàn)出顯著上調(diào)表達(dá)。研究結(jié)果表明制備的兩種佐劑殺鮭氣單胞菌滅活疫苗均有效引起了虹