草魚出血病細(xì)胞滅活疫苗的免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　草魚是我國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖“四大”家魚之一，為我國淡水養(yǎng)殖第一品種。但是多年來，草魚細(xì)菌病及病毒病的多發(fā)嚴(yán)重制約了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。尤其是草魚出血病，其發(fā)病快、流行廣、死亡率高，是危害草魚最為嚴(yán)重的病毒性疾病。單靠藥物是無法解決日益嚴(yán)重的草魚出血病的蔓延，而使用高效的疫苗免疫是最有效的預(yù)防措施，因此疫苗研制對(duì)該病的防治意義重大。如何評(píng)價(jià)疫苗的有效性是疫苗研制及其合理使用的重要方法。結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，建立更準(zhǔn)確

2、、有效的疫苗評(píng)價(jià)方法是我們一直努力的目標(biāo)，它不僅為豐富魚類免疫學(xué)及疫苗免疫機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為疫苗的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)手段。
　　方法:
　　1.用巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)分離株進(jìn)行GCRV基因型分型。
　　2.采用草魚腎細(xì)胞(CIK)培養(yǎng)方法分別對(duì)GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　3.制備基因Ⅰ型、Ⅱ型

3、GCRV的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，采用絕對(duì)熒光定量PCR(absolutequantification PCR，AQ-PCR)方法分別測(cè)定GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13的病毒拷貝數(shù);并采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(tissue culture infectious dose50，TCID50)分別測(cè)定GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13的病毒滴度。
　　4.將GCRV-ZV8909和GCRV-HZ13按病毒拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果同比例混合，

4、混合病毒液用甲醛滅活后制備細(xì)胞滅活疫苗，設(shè)置原液、50倍和100倍生理鹽水稀釋及生理鹽水對(duì)照共4組;分別腹腔注射免疫20g±5g健康草魚，各組于0h及免疫后各時(shí)間點(diǎn)取草魚脾臟組織及血液。
　　5.草魚出血病細(xì)胞滅活疫苗免疫效果評(píng)價(jià):
　　(1)免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè):選取草魚主要的6種免疫因子編碼基因作為候選基因，包括草魚免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(major hist

5、ocompatibility complexⅠ，MHCⅠ)、1型干擾素(interferon1，IFN1)、補(bǔ)體3(complement3，C3)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、內(nèi)凝集素(intelectin))，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)草魚經(jīng)注射免疫不同劑量草魚出血病滅活疫苗前后脾細(xì)胞中上述免疫基因的表達(dá)，采用2-ΔΔCt方法

6、處理數(shù)據(jù)，并用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　(2)抗體水平評(píng)價(jià):
　?、俨蒴~IgM重鏈蛋白的表達(dá)及純化，并制備鼠抗多克隆抗體，western blot方法檢測(cè)其特異性，該抗體用做TAS-ELISA檢測(cè)草魚免疫抗體水平的中間抗體。
　?、诨颌裥虶CRV-ZV8909結(jié)構(gòu)蛋白VP7蛋白表達(dá)及純化，并制備多克隆抗體，western blot方法檢測(cè)其分別與GCRV-ZV8909、GCRV-HZ13的反應(yīng)。
　　

7、③分別用純化的基因Ⅰ型GCRV-ZV8909的結(jié)構(gòu)蛋白VP7蛋白及濃縮提純的基因Ⅱ型GCRV-HZ13作為包被抗原，鼠抗草魚IgM血清作為中間抗體，建立TAS-ELISA方法檢測(cè)草魚體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體水平。
　　(3)免疫保護(hù)率測(cè)定:用本實(shí)驗(yàn)室分離的基因Ⅱ型GCRV-HZ13對(duì)免疫組及對(duì)照組草魚進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.GCRV的分型
　　GCRV-ZV8909屬于基因Ⅰ型，GCRV-HZ13屬于基

8、因Ⅱ型。
　　2.GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13的病毒含量
　　運(yùn)用AQ-PCR對(duì)GCRV-ZV8909及GCRV-HZ13的RNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量，結(jié)果表明基因Ⅰ型GCRV-ZV8909拷貝數(shù)為2.0×109 copies/mL，而基因Ⅱ型GCRV-HZ13拷貝數(shù)為1.5×106copies/mL。病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明GCRV-ZV8909的TCID50為1.0×106.83TCID50/mL, GCRV-HZ1

9、3的TCID50為1.0×104.83 TCID50/mL。
　　3.從免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)草魚出血病滅活疫苗免疫效果
　　注射免疫不同劑量的草魚出血病滅活疫苗均能刺激草魚脾臟中6種主要免疫基因不同程度的上調(diào)表達(dá)，說明疫苗刺激機(jī)體啟動(dòng)了非特異性和特異性免疫應(yīng)答。在3個(gè)疫苗免疫組中，基因Intelectin、MHCⅠ、IL-1β、C3的相對(duì)表達(dá)量都隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)了先上調(diào)后下降的趨勢(shì);基因IFN1的相對(duì)表達(dá)量在6h時(shí)達(dá)到

10、高峰，之后逐漸下降直至正常水平;基因IgM的相對(duì)表達(dá)量則呈現(xiàn)出逐漸上調(diào)的趨勢(shì)。
　　4.抗體水平評(píng)價(jià)
　　(1)通過PCR擴(kuò)增，蛋白重組表達(dá)，成功獲得GCRV-ZV8909的VP7蛋白及草魚IgM蛋白。將純化的VP7蛋白及IgM蛋白分別注射小鼠后獲得鼠抗VP7血清及鼠抗草魚IgM血清。
　　(2) Western blot方法檢測(cè)鼠抗VP7血清及鼠抗草魚IgM血清的特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的2種多抗血清具有較好的特異性，間

11、接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鼠抗草魚IgM血清效價(jià)在1∶3200。
　　(3) TAS-ELISA結(jié)果表明，草魚經(jīng)腹腔注射不同劑量的細(xì)胞滅活疫苗后，與對(duì)照組相比，各免疫組血清抗體均有不同程度的提高，且原液組與50倍稀釋組基本持平，但都高于100倍稀釋組，各免疫組在免疫后5d就可檢測(cè)到抗基因Ⅰ型GCRV抗體和基因Ⅱ型GCRV的抗體，且抗體水平持續(xù)到84d，但兩種基因型抗體水平達(dá)到高峰的時(shí)間不一致，抗基因Ⅰ型GCRV抗體達(dá)到高峰是在28d

12、，抗基因Ⅱ型GCRV抗體是在14d達(dá)到高峰。兩種基因型抗體水平達(dá)到高峰時(shí)的血清效價(jià)分別是1∶800，1∶600。
　　5、免疫保護(hù)率
　　原液組的免疫保護(hù)率為67％，50倍稀釋組的免疫保護(hù)率為60％，100倍稀釋組的免疫保護(hù)率為33％。
　　結(jié)論:
　　1.與對(duì)照組相比，免疫組不同濃度的疫苗均能誘導(dǎo)草魚脾臟中免疫相關(guān)分子基因的表達(dá)上調(diào)。
　　2.所建立的TAS-ELISA方法可初步應(yīng)用于檢測(cè)草魚出血病細(xì)胞滅