牛支原體滅活疫苗的研制與免疫效果研究.pdf

1、牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）是感染牛的一種重要的致病性病原體，主要引起牛的肺炎、乳腺炎和關(guān)節(jié)炎等多種疾病。美國(guó)于1961年首次從患乳腺炎的牛乳中分離得到該病原。國(guó)內(nèi)于2008年首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離得到，此后在國(guó)內(nèi)逐步蔓延傳播，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為研發(fā)防控牛支原體病的有效疫苗，在綜合前期分析研究的基礎(chǔ)上，本文對(duì)牛支原體生長(zhǎng)滴度測(cè)定、抗原菌懸液濃縮、滅活疫苗制備以及犢牛免疫效果評(píng)價(jià)等疫苗研發(fā)關(guān)鍵技

2、術(shù)進(jìn)行了試驗(yàn)研究，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1 TTC應(yīng)用于牛支原體活菌計(jì)數(shù)研究及牛支原體擴(kuò)大培養(yǎng)效果測(cè)定
　　為探討氯化三苯基四氮唑（TTC）應(yīng)用于 M.bovis菌落計(jì)數(shù)的可行性及實(shí)驗(yàn)條件，通過平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行了 TTC濃度篩選；采用傾注培養(yǎng)法對(duì) M.bovis擴(kuò)大培養(yǎng)效果進(jìn)行了菌落形成單位（Colony forming unit，cfu）計(jì)數(shù)，通過顏色變化單位（Colour change unit，ccu）法進(jìn)行了濃

3、度檢測(cè)，并測(cè)定了630 nm處 OD值及培養(yǎng)物 pH的變化。結(jié)果：培養(yǎng)基中 TTC質(zhì)量濃度在0.3~0.6 g/L時(shí)菌落正常生長(zhǎng)且顯色效果明顯，TTC質(zhì)量濃度較低時(shí)菌落顯色效果不明顯，較高時(shí)則會(huì)抑制 M.bovis的生長(zhǎng)，TTC作用最佳質(zhì)量濃度為0.4 g/L；CFU法測(cè)得菌液濃度為1.8~2.42×108 CFU/mL，CCU法測(cè)得牛支原體菌株在96 h時(shí)的生長(zhǎng)滴度為5.0×108 CCU/mL，兩種方法檢測(cè)結(jié)果基本一致；而不同時(shí)段牛

4、支原體培養(yǎng)物 OD值變化范圍在0.024~0.213，在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn) OD值與上述兩種方法未表現(xiàn)出一致性，OD值測(cè)定僅可做為培養(yǎng)效果檢測(cè)時(shí)的輔助方法；培養(yǎng)物 pH變化與 OD值測(cè)定卻表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。結(jié)果表明：TTC可應(yīng)用于 M.bovis活菌計(jì)數(shù)，菌落呈醒目紅色且特征明顯，可有效、準(zhǔn)確地對(duì) M.bovis進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；CFU法與 CCU法均可應(yīng)用于牛支原體擴(kuò)大培養(yǎng)效果測(cè)定。
　　2牛支原體生長(zhǎng)曲線測(cè)定及不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)效果比較

5、r>　　通過顏色變化單位法（Colour change unit，ccu）對(duì)牛支原體新疆分離株在牛支原體專用液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)階段的生長(zhǎng)滴度進(jìn)行了測(cè)定并繪制了生長(zhǎng)曲線，同時(shí)采用活菌計(jì)數(shù)法對(duì)牛支原體菌株在牛支原體專用液體擴(kuò)大培養(yǎng)基、改良 Thiaucourt’s培養(yǎng)基、牛心湯培養(yǎng)基、葡萄糖血清肉湯培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：活化培養(yǎng)后的牛支原體菌株在牛支原體專用液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，該培養(yǎng)基相比其他三種培養(yǎng)基具有一定

6、的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，可作為制備疫苗時(shí)牛支原體抗原獲取的最優(yōu)培養(yǎng)基。
　　3牛支原體滅活疫苗的研制
　　采用透析法、高速離心法及超濾濃縮法對(duì) M.bovis培養(yǎng)物進(jìn)行了濃縮試驗(yàn)對(duì)比研究，測(cè)定不同處理方法濃縮物蛋白含量，并利用 CFU與 CCU法測(cè)定了超濾濃縮后濃縮液濃度；應(yīng)用 ISA206雙相佐劑制備 M.bovis滅活疫苗，先后進(jìn)行了疫苗無菌檢測(cè)、物理性狀檢測(cè)、穩(wěn)定性與保存期試驗(yàn)、動(dòng)物安全性試驗(yàn)，結(jié)果顯示超濾濃縮法處理得到的濃縮物蛋

7、白濃度最高，CFU法與 CCU法檢測(cè)結(jié)果基本一致；所制備疫苗物理性狀良好，4℃可保存180 d、37℃可存放3 d，受試動(dòng)物接種后未見異常反應(yīng)，注射部位均正常，未見化膿及紅腫現(xiàn)象。結(jié)果表明：超濾濃縮法適用于 M.bovis培養(yǎng)物的濃縮，可用于疫苗生產(chǎn)時(shí)抗原的富集；疫苗安全可靠，為 M.bovis滅活疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了一定的方法與技術(shù)支持。
　　4牛支原體滅活疫苗免疫小鼠最小免疫劑量及抗體消長(zhǎng)規(guī)律初步研究
　　應(yīng)用牛支原體

8、滅活疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行最小免疫劑量及抗體消長(zhǎng)規(guī)律初步研究。將制備的疫苗分別以0.1、0.2、0.3、0.4 mL/只的不同劑量，經(jīng)腿部肌肉途徑免疫小鼠，結(jié)果顯示最小免疫劑量為0.2 mL/只；以0.2 mL/只劑量免疫小鼠，免疫3周后，抗體滴度達(dá)到最高峰，隨后抗體滴度開始下降，但仍保持相對(duì)穩(wěn)定，5周后抗體滴度表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。
　　5牛支原體滅活疫苗免疫犢牛的免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)
　　隨機(jī)選取10-15日齡犢牛20頭，免疫組10頭于10

9、-15日齡首免，間隔10天進(jìn)行二免，肌肉注射3 mL/每頭，未免疫組10頭不注射疫苗，注射等劑量生理鹽水。測(cè)定兩組犢牛二免后14 d抗體水平并在二免后21 d隨機(jī)選取相同日齡免疫與未免疫犢牛各3頭進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，每頭犢牛經(jīng)鼻腔黏膜接種（滴注）2 mL、氣管注射3 mL牛支原體培養(yǎng)物（1.8×109 CFU/mL），記錄犢牛體溫，觀察臨床癥狀，檢測(cè)血清抗體水平。攻毒后28 d剖檢觀察肺臟臨床解剖學(xué)及病理組織學(xué)變化，記錄犢牛肺臟病變指數(shù)并

10、采集病變肺臟組織進(jìn)行牛支原體分離培養(yǎng)。結(jié)果：免疫組犢牛在二免后14 d血清牛支原體抗體達(dá)到0.404（OD450）；3頭攻毒犢牛均保持良好的精神狀態(tài)且體溫變化不明顯，臨床癥狀綜合評(píng)分為3，肺臟病變指數(shù)為2，肺臟解剖學(xué)及病理組織學(xué)觀察無異常且肺臟中未分離回收到牛支原體。未免疫組犢牛同期血清牛支原體抗體為0.142（OD450）；3頭攻毒犢牛均先后出現(xiàn)體溫升高、輕度咳喘、膿性鼻液，明顯消瘦等癥狀，臨床癥狀綜合評(píng)分為11，肺臟病變指數(shù)為17，