高濃度皮質(zhì)醇介導(dǎo)慢性心理應(yīng)激和動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥機(jī)制研究.pdf

1、背景: 心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病。其危險(xiǎn)因素有很多，如高脂血癥、高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等。但流行病學(xué)研究表明：大約40％的動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的病人與上述危險(xiǎn)因素?zé)o關(guān)，而與慢性心理應(yīng)激密切相關(guān)。與AS相關(guān)的心理應(yīng)激主要有負(fù)性情感、焦慮情緒、工作緊張等諸多心理社會(huì)應(yīng)激。因此，進(jìn)行心理應(yīng)激與AS的相關(guān)研究在AS的預(yù)防和治療中具有深遠(yuǎn)的意義。 目前，AS的發(fā)病機(jī)制有三種比較公

2、認(rèn)的學(xué)說(shuō)，即脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)和內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)。國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于慢性心理應(yīng)激與這三種學(xué)說(shuō)的相關(guān)關(guān)系的研究，但迄今為止，這些研究都無(wú)法清楚地解釋慢性心理應(yīng)激是如何影響AS的發(fā)生、發(fā)展、結(jié)局。因此，這個(gè)領(lǐng)域期待著新的思路。近年來(lái)，炎癥學(xué)說(shuō)在AS的發(fā)病機(jī)制中越來(lái)越重要。這個(gè)學(xué)說(shuō)認(rèn)為：AS是發(fā)生在動(dòng)脈壁上的慢性炎癥反應(yīng)，AS每一步特征性的損害代表著慢性炎癥反應(yīng)的不同階段。而長(zhǎng)期慢性心理應(yīng)激不僅降低了內(nèi)源性抗炎物質(zhì)--皮質(zhì)醇的抗炎效果

3、，而且還擴(kuò)大了炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)了動(dòng)脈壁的損傷。 然而，高濃度的皮質(zhì)醇是通過(guò)促進(jìn)了哪些炎癥因子的分泌，進(jìn)而加速了AS的發(fā)生發(fā)展呢？此外，在心理應(yīng)激導(dǎo)致AS的不同階段，這些炎癥因子的濃度變化趨勢(shì)是怎樣的？要研究這些問(wèn)題，首先要建立慢性心理應(yīng)激誘發(fā)AS的動(dòng)物模型。建立這種模型需要滿足兩個(gè)條件：首先要有出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化病灶的可能性，其次要可操作性強(qiáng)，能便于動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)物的行為變化。但目前還沒(méi)有成熟的動(dòng)物模型。 因此，需要建立與人

4、類慢性心理應(yīng)激病變特征相似的慢性心理應(yīng)激動(dòng)物模型，并檢測(cè)其血清中與AS密切相關(guān)的炎性因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocte chemoattractant protein-1，MCP-1），巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF），腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha， TNF-α）和C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein

5、， CRP）等的水平，觀察這些炎癥因子在心理應(yīng)激導(dǎo)致AS的不同階段的濃度變化趨勢(shì)，以及這種變化趨勢(shì)是否與高濃度的皮質(zhì)醇密切相關(guān)。 目的: （1）建立與人類長(zhǎng)期慢性心理應(yīng)激病變特征相似，易于動(dòng)態(tài)觀察慢性心理應(yīng)激對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化影響的動(dòng)物模型。 （2）比較心理應(yīng)激誘導(dǎo)的AS和高脂飲食誘導(dǎo)的AS不同階段的炎癥因子濃度變化趨勢(shì)。 （3）篩選出既與皮質(zhì)醇濃度變化密切相關(guān)，又與AS密切相關(guān)的炎性因子。 方法:

6、 1.實(shí)驗(yàn)分組。 健康雄性純種新西蘭大白兔160只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、高脂組（B組）、慢性心理應(yīng)激組（C組）和高脂加慢性心理應(yīng)激組（D組）各40只。A組、C組給予普通顆粒飼料喂養(yǎng)，B組、D組給予含1％膽固醇的高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)周期為16周。 2.動(dòng)物模型的建立。 對(duì)C組和D組的80只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行慢性不可預(yù)見(jiàn)性心理應(yīng)激：第一天噪音刺激3h，第二天旋轉(zhuǎn)60 min（80轉(zhuǎn)/min），第三天狗驚嚇60 min（

7、在一個(gè)放狗的大籠子里加一道柵欄，將其一分為二，狗不能鉆過(guò)柵欄，一邊放狗，一邊放兔子），第四天把兔子放進(jìn)塑料網(wǎng)兜懸掛4h，第五天足底電擊60 min（110 v，1次/min），第六天斷水24 h，第七天斷食24 h，以七天為一個(gè)周期，下一個(gè)周期在上一個(gè)周期的基礎(chǔ)上增加10 min。實(shí)驗(yàn)周期共為16周。 3.動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)。 （1）于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后每4周分別記錄所有實(shí)驗(yàn)兔飲食量，體重，血壓，心率，血清皮質(zhì)醇和炎癥因子的水平

8、。 （2）于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察并記錄所有實(shí)驗(yàn)兔自我修飾行為的變化。 4.血脂檢測(cè)。 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、4周、8周、12周及16周末采血做血液生化檢查。采用酶聯(lián)法測(cè)定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（high-densit

9、ylipoprotein cholesterol， HDL-C）水平。 5.血清皮質(zhì)醇及炎性因子的檢測(cè)。 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、4周、8周、12周及16周末采血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清皮質(zhì)醇（corticosterone，CORT）、高敏C反應(yīng)蛋白（high sensitivity C-reactrve protein， hs-CRP）和腫瘤壞

10、死因子-α（TNF-α）的水平。 6.高頻體表超聲檢查。 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、8周末、12周末、24周末行腹主動(dòng)脈高頻體表超聲檢查。測(cè)量動(dòng)脈舒張末期內(nèi)徑（end-diastolic luminal diameter，Dd）、動(dòng)脈收縮末期內(nèi)徑（end-systolic luminal diameter， Ds）、腹主動(dòng)脈后壁內(nèi)膜.中層厚度（Intima-Media Thickness，IMT）、腹主動(dòng)脈收縮期血流峰值速度（pe

11、ak velocity，Vp）、收縮期平均速度（mean velocity， Vm）和收縮期流速積分（velocity integral，VTI）。將內(nèi)-中膜平均回聲強(qiáng)度AⅡ-Ⅰ與外膜平均回聲強(qiáng)度AⅡ-A的比值作為內(nèi)-中膜校正的AD值（AⅡc％），AⅡc％=AⅡ-Ⅰ/（AⅡ-A）×100％。 7.病理染色。 留取腹主動(dòng)脈標(biāo)本，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，油紅O（red-oil O）染色。

12、 8.免疫組織化學(xué)染色。 行TNF-α、MIF、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10免疫組織化學(xué)染色。 9.Real-time PCR。 檢測(cè)血管組織中TNF-α、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10的mRNA表達(dá)水平，并以管家基因GAPDH作為參照。 10.Western blot。 檢測(cè)血管組織中TNF-α、ET-1、CRP、eNOS、MCP-1及IL-10

13、的蛋白表達(dá)水平。 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 連續(xù)性數(shù)據(jù)用x±SD表示，離散數(shù)據(jù)用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示。組內(nèi)比較服從正態(tài)分布的資料采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)，組間差異性比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（version 13.0； SPSS Inc），P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論: （1）建立了與人類長(zhǎng)期慢性心理應(yīng)激病變特征相似，易于觀察慢性心理應(yīng)激對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化影響的動(dòng)物模型。