MicroRNA-155對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome ACS)是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征。ASC是冠心病的一種嚴(yán)重類型，致死率較高，其風(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)自于不穩(wěn)定斑塊，病理上稱為易損斑塊。易損斑塊的特征為較薄的纖維帽、大量脂質(zhì)構(gòu)成的核心，以及斑塊肩部累積的豐富的巨噬-泡沫細(xì)胞炎癥因子。臨床和病理學(xué)研究都表明，持續(xù)的慢性炎癥對(duì)血管的刺激在動(dòng)脈粥

2、樣硬化中的扮演著關(guān)鍵性的角色。單核細(xì)胞遷移進(jìn)入血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞后，吞噬斑塊中累積的脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，分泌大量的炎癥因子并在斑塊內(nèi)堆積，是促進(jìn)斑塊發(fā)生發(fā)展的重要因素。目前認(rèn)為減少單核細(xì)胞募集和炎癥是延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。因此，炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)分子在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)，小分子RNA(MicroRNAs，miRNAs)能對(duì)免疫及炎癥反應(yīng)起到顯著的調(diào)節(jié)作用，

3、該作用主要是通過(guò)導(dǎo)致其靶標(biāo)分子mRNA的降解或翻譯的抑制，調(diào)節(jié)靶標(biāo)分子轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)。有研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)miR-155的水平明顯增高，并可通過(guò)不同的靶標(biāo)分子對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，microRNA-155(miR-155)也是一個(gè)與炎癥有關(guān)的miRNAs，能夠通過(guò)作用于不同的靶標(biāo)分子調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。但miR-155對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥和斑塊穩(wěn)定性的影響及機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。
　　為此，本課題計(jì)劃

4、首先篩選與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥相關(guān)的miR-155的靶標(biāo)分子并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，然后觀察miR-155及其靶標(biāo)分子對(duì)oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞炎癥的影響，最后采用antagomir對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠miR-155的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，觀察miR-155表達(dá)抑制是否有利于改善動(dòng)脈粥樣硬化炎癥及斑塊穩(wěn)定性，為動(dòng)脈粥樣硬化治療的研究提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.生物信息學(xué)分析并鑒定THP-1細(xì)胞中miR-155的靶標(biāo)分子
　　(1)利用靶

5、標(biāo)分析軟件TargetScan、Miranda預(yù)測(cè)，結(jié)合文獻(xiàn)查閱，篩選出動(dòng)脈粥樣硬化炎癥相關(guān)的miR-155靶基因;
　　(2)構(gòu)建作用靶點(diǎn)雙螢光素酶報(bào)告載體，與miR-155 mimic（過(guò)表達(dá)miR-155）或inhibitor（抑制miR-155表達(dá)）共轉(zhuǎn)染至PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中，觀察miR-155是不是能夠與靶基因3'-UTR區(qū)中預(yù)測(cè)的位點(diǎn)結(jié)合;
　　(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和Western

6、blot(WB)檢測(cè)miR-155對(duì)靶標(biāo)分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　2.miR-155及siRNA干擾靶標(biāo)分子對(duì)oxLDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥的影響:
　　(1) PMA誘導(dǎo)24h，oxLDL(50μ g/ml)刺激THP-1巨噬細(xì)胞24h，miR-155mimic、inhibitor及miR-155靶標(biāo)分子siRNA分別轉(zhuǎn)染24h后收樣;
　　(2)實(shí)時(shí)定量PCR法、ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α

7、、IL-1β、趨化因子CCL2、CCL4和CCL7的表達(dá)變化情況;
　　(3) Western blot檢測(cè)STAT3和IκBα的磷酸化水平，ELISA法檢測(cè)NF-κβ活化水平。
　　3.干擾動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠體內(nèi)miR-155水平對(duì)其炎癥及斑塊進(jìn)展的影響:
　　(1)通過(guò)antagomir-155的使用，建立miR-155表達(dá)抑制的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型:ApoE-/-小鼠（6周齡）高脂喂養(yǎng)12周，將模型小鼠按照mi

8、R-155對(duì)照組和miR-155抑制組分組，每組16只，分別尾靜脈注射生理鹽水配制的antagomir control和antagomir-155，連續(xù)注射3天，繼續(xù)喂養(yǎng)3周后處死，收集外周血、骨髓單核細(xì)胞(bonemarrow mononuclear cells，BMMCs)和胸腹主動(dòng)脈組織以檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。
　　(2)取主動(dòng)脈行石蠟切片，HE染色檢測(cè)主動(dòng)脈斑塊的形態(tài)，MASSON染色檢測(cè)斑塊內(nèi)膠原的沉積情況，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)斑

9、塊內(nèi)巨噬細(xì)胞(CD68)、平滑肌(SMA)和我們預(yù)測(cè)的miR-155靶標(biāo)分子的表達(dá)情況。
　　(3)實(shí)時(shí)定量PCR法分別檢測(cè)miR-155水平變化情況。
　　(4)實(shí)時(shí)定量PCR法、ELISA法檢測(cè)趨化因子TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的表達(dá)變化情況。
　　(5)Western blot檢測(cè)STAT3和IκBα的磷酸化水平，ELISA法檢測(cè)NF-κB活化水平。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)所得數(shù)

10、據(jù)資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的方式表示。數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)(t-student)或單因素方差分析比較(One-way ANOVA)，以P＜0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1.利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到miR-155的靶基因:細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)和Sirtuin1(SIRT1);
　　2.通過(guò)

11、構(gòu)建含miR-155作用靶點(diǎn)的雙熒光素酶報(bào)告載體和GFP報(bào)告載體，證實(shí)了miR-155能與SOCS1、SIRT1 mRNA上預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合;結(jié)果表明，miR-155能顯著抑制SOCS1、SIRT1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05)。
　　3.miR-155對(duì)oxLDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥的影響:
　　(1)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示miR-155在oxLDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01

12、)。
　　(2) miR-155表達(dá)抑制時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR及ELISA結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的mRNA及蛋白水平均顯著降低(P＜0.01)，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性也明顯降低(P＜0.05);當(dāng)miR-155過(guò)表達(dá)及siRNA干擾SOCS1、SIRT1后，TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的mRNA及蛋白水平顯著升高(P＜0.01)，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性也明顯升高(P＜0.05)。<

13、br>　　(3) Western Blot結(jié)果顯示miR-155抑制時(shí)，IκBα、STAT3磷酸化水平顯著降低，miR-155過(guò)表達(dá)及siRNA干擾SOCS1后，Iκβα、STAT3磷酸化水平顯著升高;此外，當(dāng)miR-155抑制時(shí)，p65乙?；浇档停鴐iR-155過(guò)表達(dá)及siRNA干擾SIRT1后，p65乙?；皆黾印?br>　　(4) Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-155表達(dá)抑制可降低THP-1巨噬細(xì)胞的遷移能力，而m

14、iR-155過(guò)表達(dá)及siRNA干擾SOCS1、SIRT1后，THP-1巨噬細(xì)胞的遷移能力有所增加(P＜0.05)。
　　3.干擾動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠體內(nèi)miR-155水平對(duì)其炎癥及斑塊進(jìn)展的影響:
　　(1)尾靜脈注射antagomir-155，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠血清、血管組織及BMMCs中miR-155的水平均顯著降低(P＜0.01)，成功建立了miR-155表達(dá)抑制的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠。
　　(2) anta

15、gomir-155抑制miR-155的水平后，小鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，同時(shí)可顯著減少斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、增加膠原含量及平滑肌細(xì)胞(P＜0.05)。
　　(3) antagomir-155作用后，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)及血管組織中的SOCS1、SIRT1均增加，同時(shí)STAT3、IκB磷酸化水平降低，NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性也降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:

16、>　　1.預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了hsa-SOCS1和hsa-SIRT1為hsa-miR-155的靶標(biāo)分子;此外，miR-155對(duì)SOCS1和SIRT1的抑制作用可能是通過(guò)介導(dǎo)它們mRNA的降解。
　　2.miR-155可促進(jìn)oxLDL刺激的THP-1巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能包括:miR-155通過(guò)抑制它的靶標(biāo)分子SOCS1和SIRT1，進(jìn)而促進(jìn)STAT3和NF-κB信號(hào)途徑，使炎癥細(xì)胞因子及趨化因子增多，單核巨噬細(xì)胞遷移增加。