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文檔簡介
1、研究背景及目的:
急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome ACS)是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛,繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的一組臨床綜合征。ASC是冠心病的一種嚴重類型,致死率較高,其風險主要來自于不穩(wěn)定斑塊,病理上稱為易損斑塊。易損斑塊的特征為較薄的纖維帽、大量脂質構成的核心,以及斑塊肩部累積的豐富的巨噬-泡沫細胞炎癥因子。臨床和病理學研究都表明,持續(xù)的慢性炎癥對血管的刺激在動脈粥
2、樣硬化中的扮演著關鍵性的角色。單核細胞遷移進入血管內皮轉化為巨噬細胞后,吞噬斑塊中累積的脂質形成泡沫細胞,分泌大量的炎癥因子并在斑塊內堆積,是促進斑塊發(fā)生發(fā)展的重要因素。目前認為減少單核細胞募集和炎癥是延緩動脈粥樣硬化的進展、穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊的關鍵環(huán)節(jié)之一。因此,炎癥反應的免疫調節(jié)分子在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用。
研究發(fā)現(xiàn),小分子RNA(MicroRNAs,miRNAs)能對免疫及炎癥反應起到顯著的調節(jié)作用,
3、該作用主要是通過導致其靶標分子mRNA的降解或翻譯的抑制,調節(jié)靶標分子轉錄后水平的基因表達。有研究顯示動脈粥樣硬化時miR-155的水平明顯增高,并可通過不同的靶標分子對動脈粥樣硬化發(fā)揮調節(jié)作用。同時,microRNA-155(miR-155)也是一個與炎癥有關的miRNAs,能夠通過作用于不同的靶標分子調控巨噬細胞炎癥反應。但miR-155對動脈粥樣硬化炎癥和斑塊穩(wěn)定性的影響及機制仍不明確,有待進一步研究。
為此,本課題計劃
4、首先篩選與動脈粥樣硬化炎癥相關的miR-155的靶標分子并通過實驗驗證,然后觀察miR-155及其靶標分子對oxLDL刺激的巨噬細胞炎癥的影響,最后采用antagomir對動脈粥樣硬化小鼠miR-155的表達進行干預,觀察miR-155表達抑制是否有利于改善動脈粥樣硬化炎癥及斑塊穩(wěn)定性,為動脈粥樣硬化治療的研究提供基礎。
方法:
1.生物信息學分析并鑒定THP-1細胞中miR-155的靶標分子
(1)利用靶
5、標分析軟件TargetScan、Miranda預測,結合文獻查閱,篩選出動脈粥樣硬化炎癥相關的miR-155靶基因;
(2)構建作用靶點雙螢光素酶報告載體,與miR-155 mimic(過表達miR-155)或inhibitor(抑制miR-155表達)共轉染至PMA誘導的THP-1細胞中,觀察miR-155是不是能夠與靶基因3'-UTR區(qū)中預測的位點結合;
(3)實時熒光定量PCR(RT-PCR)和Western
6、blot(WB)檢測miR-155對靶標分子mRNA和蛋白表達的影響。
2.miR-155及siRNA干擾靶標分子對oxLDL刺激的THP-1巨噬細胞炎癥的影響:
(1) PMA誘導24h,oxLDL(50μ g/ml)刺激THP-1巨噬細胞24h,miR-155mimic、inhibitor及miR-155靶標分子siRNA分別轉染24h后收樣;
(2)實時定量PCR法、ELISA法檢測炎癥因子TNF-α
7、、IL-1β、趨化因子CCL2、CCL4和CCL7的表達變化情況;
(3) Western blot檢測STAT3和IκBα的磷酸化水平,ELISA法檢測NF-κβ活化水平。
3.干擾動脈粥樣硬化模型小鼠體內miR-155水平對其炎癥及斑塊進展的影響:
(1)通過antagomir-155的使用,建立miR-155表達抑制的動脈粥樣硬化小鼠模型:ApoE-/-小鼠(6周齡)高脂喂養(yǎng)12周,將模型小鼠按照mi
8、R-155對照組和miR-155抑制組分組,每組16只,分別尾靜脈注射生理鹽水配制的antagomir control和antagomir-155,連續(xù)注射3天,繼續(xù)喂養(yǎng)3周后處死,收集外周血、骨髓單核細胞(bonemarrow mononuclear cells,BMMCs)和胸腹主動脈組織以檢測各項指標。
(2)取主動脈行石蠟切片,HE染色檢測主動脈斑塊的形態(tài),MASSON染色檢測斑塊內膠原的沉積情況,免疫組織化學法檢測斑
9、塊內巨噬細胞(CD68)、平滑肌(SMA)和我們預測的miR-155靶標分子的表達情況。
(3)實時定量PCR法分別檢測miR-155水平變化情況。
(4)實時定量PCR法、ELISA法檢測趨化因子TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的表達變化情況。
(5)Western blot檢測STAT3和IκBα的磷酸化水平,ELISA法檢測NF-κB活化水平。
4.統(tǒng)計學分析:實驗所得數(shù)
10、據(jù)資料用均值±標準差(mean±SD)的方式表示。數(shù)據(jù)通過SPSS15.0軟件進行t檢驗(t-student)或單因素方差分析比較(One-way ANOVA),以P<0.05為有顯著性差異。
結果:
1.利用生物信息學軟件預測到miR-155的靶基因:細胞因子信號轉導抑制因子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)和Sirtuin1(SIRT1);
2.通過
11、構建含miR-155作用靶點的雙熒光素酶報告載體和GFP報告載體,證實了miR-155能與SOCS1、SIRT1 mRNA上預測的結合位點結合;結果表明,miR-155能顯著抑制SOCS1、SIRT1 mRNA及蛋白水平的表達(P<0.05)。
3.miR-155對oxLDL刺激的THP-1巨噬細胞炎癥的影響:
(1)實時定量PCR結果顯示miR-155在oxLDL刺激的THP-1巨噬細胞中表達顯著上調(P<0.01
12、)。
(2) miR-155表達抑制時,實時定量PCR及ELISA結果顯示TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的mRNA及蛋白水平均顯著降低(P<0.01),NF-κB轉錄活性也明顯降低(P<0.05);當miR-155過表達及siRNA干擾SOCS1、SIRT1后,TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.01),NF-κB轉錄活性也明顯升高(P<0.05)。<
13、br> (3) Western Blot結果顯示miR-155抑制時,IκBα、STAT3磷酸化水平顯著降低,miR-155過表達及siRNA干擾SOCS1后,Iκβα、STAT3磷酸化水平顯著升高;此外,當miR-155抑制時,p65乙酰化水平降低,而miR-155過表達及siRNA干擾SIRT1后,p65乙酰化水平增加。
(4) Transwell實驗結果顯示miR-155表達抑制可降低THP-1巨噬細胞的遷移能力,而m
14、iR-155過表達及siRNA干擾SOCS1、SIRT1后,THP-1巨噬細胞的遷移能力有所增加(P<0.05)。
3.干擾動脈粥樣硬化模型小鼠體內miR-155水平對其炎癥及斑塊進展的影響:
(1)尾靜脈注射antagomir-155,實時定量PCR檢測小鼠血清、血管組織及BMMCs中miR-155的水平均顯著降低(P<0.01),成功建立了miR-155表達抑制的動脈粥樣硬化模型小鼠。
(2) anta
15、gomir-155抑制miR-155的水平后,小鼠血清內TNF-α、IL-1β、CCL2、CCL4和CCL7的表達水平顯著降低(P<0.01),同時可顯著減少斑塊內的巨噬細胞、增加膠原含量及平滑肌細胞(P<0.05)。
(3) antagomir-155作用后,動脈粥樣硬化斑塊內及血管組織中的SOCS1、SIRT1均增加,同時STAT3、IκB磷酸化水平降低,NF-κB的轉錄活性也降低(P<0.05)。
結論:
16、> 1.預測并驗證了hsa-SOCS1和hsa-SIRT1為hsa-miR-155的靶標分子;此外,miR-155對SOCS1和SIRT1的抑制作用可能是通過介導它們mRNA的降解。
2.miR-155可促進oxLDL刺激的THP-1巨噬細胞的炎癥反應,其機制可能包括:miR-155通過抑制它的靶標分子SOCS1和SIRT1,進而促進STAT3和NF-κB信號途徑,使炎癥細胞因子及趨化因子增多,單核巨噬細胞遷移增加。
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