點(diǎn)陣Er-YAG激光介導(dǎo)安全可控的抗體透皮研究.pdf

1、目的：透皮給藥系統(tǒng)（Transdermal drug delivery system，TDDS）是一種理想的給藥方式，具有廣闊的市場前景。近年來，化學(xué)促滲劑、納米技術(shù)、離子導(dǎo)入、超聲、微針、射頻或熱消融等各種理化方法的引入，打開了生物大分子的透皮大門。然而，它們在幫助藥物克服皮膚屏障功能，實(shí)現(xiàn)有效TDDS的同時，對皮膚產(chǎn)生的刺激和破壞也成為TDDS的主要問題。尋找既對皮膚刺激性小、又能幫助生物大分子透皮的方法，是經(jīng)皮給藥領(lǐng)域的一個難點(diǎn)。

2、在本文研究中，我們選擇創(chuàng)傷小、修復(fù)快、可控性好的點(diǎn)陣Er:YAG激光，探索了其對水溶性熒光抗體（四甲基異硫氰酸羅丹明-羊抗小鼠IgG，簡稱T-IgG，分子量約150kDa）的體內(nèi)外透皮作用，擬實(shí)現(xiàn)有效、安全、可控的TDDS。
　　方法：以SD幼鼠（3-5d）背部皮膚為模型，我們采用經(jīng)典Franz擴(kuò)散法觀察了24h中T-IgG透過點(diǎn)陣激光處理皮膚的體外透皮效應(yīng)，并探索了不同點(diǎn)陣能量（0，12.5，25，37.5 J/cm2）、點(diǎn)陣密

3、度（0；5％，100孔/cm2；10％，210孔/cm2）及抗體濃度（0，0.5，1，2μg/μl）在不同時間點(diǎn)（2h、4h、6h、8h、20h、24h）對T-IgG透皮的影響。Western blot被用于評估T-IgG體外透皮24h后與小鼠IgG結(jié)合的生物活性。在體內(nèi)透皮研究中，組織冰凍切片與共聚焦顯微鏡被分別用于觀察T-IgG活體透皮2h、4h、6h、24h后在SD幼鼠皮膚矢狀面及冠狀面中的分布，以探索點(diǎn)陣激光介導(dǎo)T-IgG的透皮

4、途徑。
　　結(jié)果：SD幼鼠皮膚的組織病理顯示：角質(zhì)層、活性表皮層、真皮及皮下脂肪層分別約為20-40μm、30-50μm、80-100μm、90-150μm，皮膚總厚度約300-400μm；以12.5，25和37.5 J/cm2三種點(diǎn)陣激光能量處理SD幼鼠皮膚后，可分別形成約50μm、100μm和150μm深的微孔道。在整個24h體外透皮試驗(yàn)中，T-IgG在完整皮膚對照組（未經(jīng)激光處理組）中的累積透皮量分別為0.282±0.013

5、（2h），0.353±0.018（4h），0.430±0.029（6h），0.522±0.027（8h），0.746±0.108（20h）和0.748±0.083μg/cm2（24h）；PBS對照組中的累積透皮量（透過物多為皮膚組織中的非特異蛋白）分別為0.213±0.021（2h），0.278±0.011（4h），0.342±0.039（6h），0.402±0.048（8h），0.581±0.032（20h），0.665±0.027μ

6、g/cm2（24h）。T-IgG在完整皮膚對照組中的24h累積透皮量與PBS對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而與點(diǎn)陣激光處理組間有顯著性差異（P﹤0.001）。
　　隨著點(diǎn)陣能量的升高，24h內(nèi)T-IgG透皮量亦隨之增加，且增加幅度以透皮后期明顯。點(diǎn)陣能量為12.5，25和37.5 J/cm2時的T-IgG累積透皮量（10％點(diǎn)陣密度，2μg/μl T-IgG15μl）分別為0.755±0.142 vs.1.211±0.139

7、 vs.1.192±0.372（2h，P＞0.05）；1.769±0.419 vs.2.345±0.398 vs.2.157±0.411（4h，P＞0.05）；2.430±0.275 vs.2.795±0.621 vs.3.152±0.927（6h，P＞0.05）；2.841±0.295 vs.3.189±0.454 vs.4.299±1.629（8h，P＞0.05）；4.179±0.873 vs.6.224±0.273 vs.7.98

8、5±1.613（20h，P﹤0.001）；4.688±1.413 vs.6.367±0.215 vs.8.330±1.876μg/cm2（24h，P﹤0.001）。高能量組（37.5 J/cm2組）與低能量組（12.5 J/cm2組）間的透皮量在透皮后期（20h、24h）出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，而在透皮8h前無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　當(dāng)固定點(diǎn)陣能量為25 J/cm2、T-IgG濃度為2μg/μl時，10％點(diǎn)陣密度組與5％點(diǎn)陣密度組的累積透皮量分

9、別為0.610±0.034 vs.1.211±0.139（2h，P﹤0.05），1.128±0.077 vs.2.345±0.398（4h，P﹤0.001），1.789±0.087 vs.2.795±0.621μg/cm2（6h，P﹤0.001），2.124±0.115 vs.3.189±0.454（8h，P﹤0.001），4.997±0.335 vs.6.224±0.273（20h，P﹤0.001），6.217±0.198 vs.6.

10、367±0.215μg/cm2（24h，P＞0.05）。即隨著點(diǎn)陣密度的增加，T-IgG透皮量亦隨之增加，且增加幅度以透皮早期（8h前）明顯，8h后，增加幅度減小，24h時趨于飽和。
　　當(dāng)固定點(diǎn)陣能量和點(diǎn)陣密度（25 J/cm2，10％），T-IgG的加樣濃度從0.5μg/μl增至2μg/μl時，T-IgG累積透皮量分別為0.656±0.266 vs.1.211±0.139（2h，P＞0.05），0.791±0.146 vs.2

11、.345±0.398（4h，P﹤0.001），0.998±0.188 vs.2.795±0.621（6h，P﹤0.001），1.107±0.167 vs.3.189±0.454（8h，P﹤0.001），1.914±0.666 vs.6.224±0.273（20h，P﹤0.001）和2.439±0.804 vs.6.367±0.215μg/cm2（24h，P﹤0.001）。與0.5μg/μl濃度組相比，2μg/μl組的T-IgG透皮量在透

12、皮早期和透皮后期均呈顯著性增加。經(jīng)蛋白電泳（Western blot）進(jìn)一步分析，透皮24h后的T-IgG仍具有與鼠IgG結(jié)合的生物活性。
　　體內(nèi)透皮試驗(yàn)中，T-IgG（2μg/μl，15μl）在完整皮膚對照組中透皮2h、4h、6h及24h后，共聚焦分層掃描及冰凍切片中均未見熒光信號。在點(diǎn)陣激光處理組（25 J/cm2，10％，2μg/μl T-IgG15μl），體內(nèi)透皮2h后，共聚焦分層掃描及冰凍切片中亦未見明顯T-IgG熒光

13、；4h后，點(diǎn)陣激光處理皮膚產(chǎn)生的微孔道中出現(xiàn)紅色熒光；6h后，熒光信號增強(qiáng)，并有向微孔道周圍彌散的趨勢；透皮24h后，T-IgG在共聚焦分層掃描熒光圖中的穿透深度約150μm（到達(dá)SD幼鼠真皮層），皮膚中見彌散的紅色熒光，且以毛囊處明顯。與此同時，24h后，大部分在6h前清晰可見的點(diǎn)陣激光產(chǎn)生的微孔道已修復(fù)閉合，在冰凍切片及共聚焦熒光圖中僅見到極少數(shù)模糊的微孔。
　　結(jié)論：點(diǎn)陣Er:YAG激光能幫助150kDa的抗體大分子實(shí)現(xiàn)安全