TGF-β1對Smad7基因轉(zhuǎn)染大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表型的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、近年來隨著人均壽命的延長、腫瘤放化療的應(yīng)用，肺間質(zhì)彌漫性纖維化的發(fā)病率逐年上升。盡管目前有大量關(guān)于肺纖維化的相關(guān)研究報道，但其確切發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，且臨床上無有效的防治方法。 以往國內(nèi)外學(xué)者，包括本課題組的研究均發(fā)現(xiàn)肺纖維化時其增生的間質(zhì)細(xì)胞在免疫標(biāo)記、光鏡和電鏡形態(tài)學(xué)上具有明顯的異質(zhì)性。但限于實驗條件和理論準(zhǔn)備的不足，一直認(rèn)為肺纖維化時增生的間質(zhì)細(xì)胞主要是成肌纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MFb)，而MFb來源于肺

2、內(nèi)固有的間充質(zhì)細(xì)胞。2000年后有學(xué)者提出器官纖維化病灶內(nèi)MFb多源性學(xué)說，在肺纖維化有報道除了肺內(nèi)固有的間充質(zhì)細(xì)胞外，MFb還可能來自外周血(骨髓源性)；新近有文獻(xiàn)報道肺纖維化病灶內(nèi)肺泡II型上皮細(xì)胞可能通過上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)也可以作為MFb的部分來源。轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factorTGF-β1) 在EMT轉(zhuǎn)

3、化過程中起著重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)Smad(Sma/MothersAgainst Decapentaplegic)蛋白是TGF-β1細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中極其重要的介導(dǎo)分子。在TGF-β1與其靶細(xì)胞膜上的受體(Tβ-R)結(jié)合后，可激活受體性Smad2和Smad3，進(jìn)而與共同通路性Smad4形成三聚體轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，并在核內(nèi)相關(guān)因子的共同作用下，參與上調(diào)一些與EMT相關(guān)基因的表達(dá)。在此過程中，有研究表明，表皮生長因子(epidermal gr

4、owth factor，EGF)可能通過促生長、抑調(diào)亡作用協(xié)同TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮EMT的完全發(fā)生。 本課題首先在體外觀察TGF-β1對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系RLE-6TN表型改變的影響及相關(guān)機(jī)制；接下來采用體外穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)，觀察Smad7基因轉(zhuǎn)染大鼠RLE-6TN細(xì)胞后TGF-β1對其表型改變的影響：觀察TGF-β1及EGF聯(lián)用對RLE-6TN細(xì)胞表型、功能改變的影響及相關(guān)機(jī)制；以明確肺纖維化時肺內(nèi)成肌纖維細(xì)胞可能

5、存在的上皮源性，探索TGF-β1/Smad信號通路在肺纖維化發(fā)生中的作用，從而進(jìn)一步闡明肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，為改善肺纖維化臨床防治打好基礎(chǔ)準(zhǔn)備。 第一部分 TGF-β1 誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變 目的：檢測TGF-β1能否在體外誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)及其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：在體外培養(yǎng)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)

6、胞(REE-6TN)中加入TGF-β1(3ng/ml)后，于不同時間段收取細(xì)胞，分別采用Real-time PCR和Western Blot(W．B)檢測上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物(E-cad，CK19)及間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物 (α-SMA、 FN和Vimentin)表達(dá)的改變；W．B檢測TGF-β1對RLE-6TN細(xì)胞 p-SAPK/JNK、p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-Akt及p-Smad2蛋白表達(dá)的影響；間接細(xì)胞免疫熒光法檢

7、測α-SMA的表達(dá)；TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變采用倒置相差顯微鏡觀察；超微結(jié)構(gòu)的改變采用透射電子顯微鏡觀察；其體外遷移能力的改變采用Transwell小室檢測。 結(jié)果：加入TGF-β1到RLE-6TN細(xì)胞后，其總的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的表達(dá)是上調(diào)的，其中Vimentin的表達(dá)于1h、3h及24h上調(diào)，分別為對照組的4.03倍(P<0.01)、3.37倍(P<0.05)及2.43倍；α-SMA mRNA的表

8、達(dá)于TGF-β1作用后各時間點(diǎn)均上調(diào)，而以1h及24h為著，分別為對照組的7.39倍(P<0.01)及8.37倍(P<0.01)；FN mRNA的表達(dá)于1h、3h及6h上調(diào)，而以3h表達(dá)最高，為對照組的2.43倍(P<0.01)；在TGF-β1作用下，RLE-6TN細(xì)胞總的上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)是下調(diào)的，其中E-cad mRNA的表達(dá)從3h起開始下調(diào)，而以6h及12h為著，均為對照組的66％(P<0.05)；CK19 mRNA表達(dá)從1h起

9、下調(diào)，而以3h及24h下調(diào)最明顯，分別為對照組的46％(P<0.01)及12％(P<0.01)。另外，在TGF-β1作用下，RLE-6TN細(xì)胞的自分泌性TGF-β1mRNA的表達(dá)水平上調(diào)，而以1h、3h及24h為著，分別為對照組的4.38倍(P<0.01)、4．34倍(P<0.01)及3.23倍；RLE-6TN細(xì)胞EGFR mRNA的表達(dá)于1h、3h、6h及24h上調(diào)，而以1h最明顯，為對照組的2.92倍(P<0.01)；加入TGF-β

10、1到RLE-6TN細(xì)胞后，其p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-Akt及p-Smad2等蛋白表達(dá)上調(diào)，p-SAPK/JNK表達(dá)無明顯改變；形態(tài)學(xué)上，TGF-β1能誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞離散成單個，形態(tài)成梭形、紡錘形；超微結(jié)構(gòu)上，TGF-β1誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞特有的嗜鋨性板層小體發(fā)生變性、腫脹并隨TGF-β1作用時間延長最終完全消失；在TGF-β1作用下，部分RLE-6TN細(xì)胞表達(dá)α-SMA且遷移到微孔濾膜上的細(xì)胞數(shù)明顯增加(P

11、<0.01)。 小結(jié)：1、TGF-β1能在體外誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞 EMT；2、TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞EMT是包括Smad及EGFR下游多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后綜合作用的結(jié)果。 第二部分過表達(dá)Smad7對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN表型改變的影響 目的：檢測過表達(dá)Smad7蛋白對TGF-β1誘導(dǎo)的RLE-6TN表型改變的影響及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：pcDNA3.0-mSmad7質(zhì)粒純

12、化，酶切鑒定后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)染到大鼠RLE-6TN細(xì)胞，用G418對克隆進(jìn)行篩選，RT-PCR、W.B和免疫熒光法對陽性克隆進(jìn)行鑒定；RLE-6TN細(xì)胞Smad7基因轉(zhuǎn)染前后上皮及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物蛋白表達(dá)采用W.B檢測；在體外培養(yǎng)的陽性克隆細(xì)胞中加入TGF-β1后，于不同時間段收取細(xì)胞，分別采用Real-time PCR和W.B檢測其上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadh和CK19)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(FN、α-SMA及Vimentin)mR

13、NA和蛋白表達(dá)的影響；間接細(xì)胞免疫熒光法檢測α-SMA的表達(dá)；相差顯微鏡觀察TGF-β1對其形態(tài)改變的影響，其體外遷移能力的改變采用Transwell小室檢測。RLE-6TN細(xì)胞Smad7基因轉(zhuǎn)染前后Smad信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化采用W.B檢測。 小結(jié)：1、經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)法將Smad7基因成功轉(zhuǎn)染大鼠RLE-6TN細(xì)胞，并獲得其陽性克隆(STl和ST6)；2、Smad7轉(zhuǎn)染能在體外部分阻止TGF-β1誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞EMT

14、的發(fā)生。 第三部分 TGF-β1與EGF對RLE-6TN細(xì)胞表型、功能的影響目的：探討TGF-β1與EGF對體外培養(yǎng)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(RLE-6TN)表型、功能的影響及可能作用的機(jī)制。 方法：RLE-6TN細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時，加入0.5％DMEM/F12培液同步化24h，然后將細(xì)胞分為4組：正常RLE-6TN組、TGF-β1組、EGF組、TGF-β1+EGF組。采用免疫熒光法檢測其α-SMA的表達(dá)；W.B檢測上

15、皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cad、CK19及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA、FN及Vimentin的表達(dá)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡的影響；W.B檢測CD147、MMP2、MT1-MMP的表達(dá)。同步化24h的細(xì)胞分為3組：正常RLE-6TN組、TGF-β1組、EGF組。采用W.B分別檢測MAPKs (包括ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK)、Akt及p-Smad2蛋白的表達(dá)。 小結(jié)：1、在體外培養(yǎng)的RLE-6TN細(xì)胞體系中，單用EGF

16、不能誘導(dǎo)其發(fā)生EMT，TGF-β1及EGF合用無明顯協(xié)同誘導(dǎo)EMT發(fā)生效應(yīng)，卻能協(xié)同誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡； 2、FGF-β1誘導(dǎo)RLE-6TN EMT時，主要通過EGFR及下游信號分子參與誘導(dǎo)其MMPs表達(dá)。 結(jié)論 1、TGF-β1能在體外誘導(dǎo)大鼠肺泡Ⅱ型上皮RLE-6TN細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變； 2、TGF-β1誘導(dǎo)的上述EMT轉(zhuǎn)變是包括Smad及EGFR下游多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后綜合作用的結(jié)果； 3、經(jīng)

17、脂質(zhì)體介導(dǎo)法將Smad7基因成功轉(zhuǎn)染大鼠RLE-6TN細(xì)胞，并獲得其陽性克隆(ST1和ST6)； 4、Smad7轉(zhuǎn)染能在體外部分阻止TGF-β1誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞EMT的發(fā)生； 5、在體外培養(yǎng)的RLE-6TN細(xì)胞體系中，單用EGF不能誘導(dǎo)其發(fā)生EMT，TGF-β1及EGF合用無明顯協(xié)同誘導(dǎo)EMT發(fā)生效應(yīng)，卻能協(xié)同誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡； 6、TGF-β1誘導(dǎo)RLE-6TN EMT 時，主要通過EGFR 及下游信號分子