機械性創(chuàng)傷誘發(fā)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡機制的研究.pdf

1、研究目的：1建立機械性創(chuàng)傷大鼠模型；TNF-a、腎上腺素損傷大鼠模型；拉貝洛爾干預(yù)大鼠模型。2 觀察機械性創(chuàng)傷時肺組織中FoxA1mRNA和蛋白質(zhì)的表達改變及肺組織中肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡。3 觀察TNF-a、腎上腺素對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞FoxA1mRNA、蛋白質(zhì)表達的影響及大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡。4 研究TNF-a、腎上腺素對大鼠肺組織中FoxA1mRNA、蛋白質(zhì)表達的影響及大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡。
　　 研究方法：

2、1機械性創(chuàng)傷對大鼠肺組織FoxA1mRNA和蛋白及大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的影響建立非致死性機械性創(chuàng)傷模型：麻醉大鼠后，將其置于Noble-Collip 創(chuàng)傷儀（直徑12英寸），以40rpm的轉(zhuǎn)速，旋轉(zhuǎn)200圈，造成大鼠非致死性創(chuàng)傷。以ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-a、腎上腺素含量；使用實時熒光定量PCR和免疫蛋白印跡檢測創(chuàng)傷組和偽創(chuàng)傷組大鼠肺組織FoxA1mRNA的表達的變化；對大鼠肺組織切片進行TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮細胞特異

3、性標志物SP-C 染色檢測大鼠肺組織中凋亡的肺泡Ⅱ型上皮細胞。2 TNF-a、腎上腺素體內(nèi)實驗對肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響建立TNF-a、腎上腺素損傷離體細胞模型：100ng/mlTNF-a和2000ng/ml 鹽酸腎上腺素刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞。運用熒光定量PCR、免疫蛋白印跡檢測TNF-a、腎上腺素對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞FoxA1mRNA、蛋白質(zhì)表達，同時運用流式細胞術(shù)檢測大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡。3 TNF-a、腎上腺素體內(nèi)實驗對

4、肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響建立TNF-a、腎上腺素損傷大鼠模型：向大鼠腹腔分別注射TNF-α（2.5ug/kg）、鹽酸腎上腺素（1ml/kg）；拉貝洛爾干預(yù)模型：在給大鼠灌胃鹽酸拉貝洛爾后3h、6h、24h后再放入Noble-Collip 創(chuàng)傷儀以40r/min 轉(zhuǎn)動200圈造成機械性創(chuàng)傷。運用免疫蛋白印跡檢測這三種模型中大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞FoxA1蛋白質(zhì)表達，通過TUNEL和SP-C免疫組化染色對比，檢測大鼠肺組織中肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋

5、亡，同時運用ELISA 法檢測三種大鼠模型中血清中TNF-a、腎上腺素含量。
　　 研究結(jié)果：1機械性創(chuàng)傷對大鼠肺組織FoxA1mRNA和蛋白及大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的影響1.1機械性創(chuàng)傷對大鼠分泌腎上腺素和TNF-α的影響以ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-a、腎上腺素含量，創(chuàng)傷后各時間點血清中腎上腺素和TNF-α含量逐漸上升，分別于創(chuàng)傷后6h和3h 達高峰，峰值為（1.7560±0.1311）ng/ml和135.0898

6、±1.5349(ng/l)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）1.2 機械性創(chuàng)傷致繼發(fā)性肺損傷對FoxA1mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響使用實時熒光定量PCR和免疫蛋白印跡檢測創(chuàng)傷組和偽創(chuàng)傷組大鼠肺組織FoxA1mRNA的表達的變化。結(jié)果顯示創(chuàng)傷組FoxA1mRNA表達較偽創(chuàng)傷組增高，F(xiàn)oxA1蛋白表達在創(chuàng)傷組均高于偽創(chuàng)傷組，于創(chuàng)傷后24h 達到高峰（P<0.01）。1.3 機械性創(chuàng)傷對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的影響TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮細

7、胞特異性標志物SP-C 染色結(jié)果表明大鼠創(chuàng)傷后出現(xiàn)肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡。2 TNF-a、腎上腺素對離體大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響2.1TNF-a、腎上腺素對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞FoxA1mRNA的表達影響使用實時熒光定量PCR和免疫蛋白印跡檢測各組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞FoxA1mRNA和蛋白質(zhì)的表達的變化。結(jié)果顯示鹽酸腎上腺素、TNF-a 刺激后FoxA1mRNA和蛋白表達明顯上升，24小時達到高峰。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。2

8、.2 TNF-a、腎上腺素對肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的影響采用流式細胞術(shù)檢測了100ng/mlTNF-a和2000ng/ml 鹽酸腎上腺素刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞后的凋亡率，結(jié)果表明，兩組刺激12小時后大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡率顯著上升，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3 TNF-a、腎上腺素體內(nèi)實驗對肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響3.1TNF-a、腎上腺素對肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響使用實時熒光定量PCR和western blot 檢測各組FoxA1蛋

9、白的表達情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxA1蛋白表達在TNF-a 注射組、鹽酸腎上腺素注射組均高于生理鹽水對照組，于創(chuàng)傷后6h 達到高峰，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）以ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-a、腎上腺素含量，結(jié)果顯示，TNF-a 注射組、鹽酸腎上腺素注射組與生理鹽水對照組相比含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性標志物SP-C 染色結(jié)果表明腹腔注射TNF-a、鹽酸腎上腺素出現(xiàn)肺泡Ⅱ型上皮

10、細胞凋亡，并且于12小時到達高峰。3.2 拉貝洛爾對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響以western blot 檢測（β-actin為內(nèi)參對照）各組中FoxA1蛋白的表達情況，F(xiàn)oxA1蛋白表達在鹽酸拉貝洛爾灌胃組均低于創(chuàng)傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。血清中腎上腺素含量的檢測結(jié)果：拉貝洛爾干預(yù)組與創(chuàng)傷組相比含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）;血清中TNF-α含量的檢測結(jié)果：拉貝洛爾干預(yù)組與創(chuàng)傷組相比含量顯著明顯降低，差異

11、有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性標志物SP-C 染色結(jié)果表明拉貝洛爾干預(yù)組與創(chuàng)傷組相比肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡明顯減少。
　　 研究結(jié)論：1機械性創(chuàng)傷使大鼠血清中TNF-a、腎上腺素水平顯著升高并且大鼠肺組織中FoxA1表達上調(diào)，導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡。2 TNF-a、腎上腺素刺激的肺泡Ⅱ型上皮細胞中FoxA1表達上調(diào)。FoxA1在TNF-a、腎上腺素誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡中具有重要作用。3 腎

12、上腺素、TNF-a水平增高引起的肺損傷類似于機械性創(chuàng)傷所導(dǎo)致的繼發(fā)性肺損傷，并且出現(xiàn)肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡。4 拉貝洛爾可以通過抑制交感神經(jīng)活性減少腎上腺素的釋放，降低TNF-a的水平，減少肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡從而減輕機械性創(chuàng)傷所導(dǎo)致的繼發(fā)性肺損傷。5 機械性創(chuàng)傷可以引起機體TNF-a、腎上腺素水平升高，其中TNF-a、腎上腺素又有相互促進作用，加重肺損傷程度，使肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡。6 拉貝洛爾對機械性創(chuàng)傷導(dǎo)致的繼發(fā)性肺損傷有保護作用。