復方五倍子抗菌劑有效成分的提取、分離及藥效學研究.pdf

1、本研究的目的是考察復方五倍子抗菌劑對魚類細菌性敗血癥的治療效果，闡明發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎，試驗包括四個部分。 1復方五倍子抗菌劑總有效成分提取條件的優(yōu)選 本試驗采用逐步比較及正交試驗設計法優(yōu)選復方五倍子抗菌劑中主要成分沒食子酸提取工藝。分別比較了水和乙醇兩種溶劑、浸漬法和回流法兩種提取方法以及醇解和酸解對沒食子酸提取含量的影響，得出酸化乙醇連續(xù)回流法提取效果最好。采用正交試驗優(yōu)化了酸化乙醇連續(xù)回流提取條件，選用正交表L9(

2、34)，考察不同濃度、提取次數(shù)、提取時間和溶劑加倍量對沒食子酸含量的影響。結果表明，各因素對試驗結果的影響順序為提取時間＞提取次數(shù)＞乙醇濃度＞溶劑加倍量，根據(jù)方差分析得出最佳提取工藝為A2B3C1D3：即加pH2的70﹪乙醇為生藥量的8倍(ml/g)，浸提3次，每次90min。在此提取條件下沒食子酸含量10.47﹪。 2復方五倍子抗菌劑有效成分分析 采用薄層層析對復方五倍子抗菌劑總提取物中的主要成分進行分析，用薄層析硅膠

3、GF254制板，以苯∶乙醇∶甲酸(7∶3∶1)為展開劑，用氨熏-三氯化鐵顯色，日光下觀察層析結果。采用薄層層析和柱層析聯(lián)用的方法，通過干法裝硅柱，以苯∶乙醇∶甲酸(7∶3∶1)作為洗脫液進行洗脫，分離得到各單體。參照理化性質(zhì)分析及薄層分析，鑒定出復方五倍子抗菌劑總有效成分包含沒食子酸、1，8-二羥基蒽醌、大黃素、蘆薈大黃素、黃芩苷、槲皮素和鞣質(zhì)七大成分。通過紫外分光光度法測定了在此提取條件下沒食子酸、蒽醌和黃酮含量分別為10.47﹪、1

4、.51﹪和4.2﹪。 3復方五倍子抗菌劑的體外抑菌和聯(lián)合用藥研究 將柱層析分離得到的主要單體成分配制成藥液，對溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、柱狀屈撓桿菌(Flexibacier)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)和遲緩愛德華菌(Edwrdsiedatorda)四種水產(chǎn)常見致病菌進行抑菌試驗，結果表明，復方五倍子抗菌劑中主要成分的抑菌活性順序為：沒食子酸＞蒽醌(包含1-8二羥基蒽醌、大黃素、

5、蘆薈大黃素)＞黃芩苷＞槲皮素＞鞣質(zhì)。以溫和氣單胞菌為菌種，將復方五倍子抗菌劑中主要有效成分兩兩配對，進行體外聯(lián)合抑菌試驗，結果表明：沒食子酸和蒽醌具有協(xié)同作用，沒食子酸和黃芩苷、沒食子酸和懈皮素、蒽醌和黃芩苷三組同屬于累加作用。 4復方五倍子抗菌劑的藥效研究 將濃度相當于生藥1000mg/ml復方五倍子抗菌劑提取物，以0.5ml/50g劑量口灌試驗鯉魚，結果顯示：試驗鯉魚一周內(nèi)無任何不良反應，死亡率為零，表明復方五倍子抗

6、菌劑總有效成分對魚體屬于實際無毒級。 以溫和氣單胞菌為致病菌種，對鯉魚進行攻毒試驗，用1.0﹪生藥料和1.0﹪制劑料對鯉魚的細菌性敗血癥進行治療，結果表明：1.0﹪生藥和1.0﹪制劑組與對照組相比死亡率差異顯著(P＜0.05)，1.0﹪生藥組和1.0﹪制劑組的效果無顯著差異(p＞0.05)。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性測定結果顯示：復方五倍子抗菌劑的生藥和制劑組都可以增強魚體非特異性免疫能力，測定生化指標肌酐、尿酸和谷丙轉氨酶結果