人深齲牙髓干細胞礦化相關蛋白質(zhì)組學分析及候選基因Stathmin功能的初步研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 隨著社會老齡化的發(fā)展，牙齒缺失已經(jīng)成為影響人類生活質(zhì)量和健康的重要因素。而我國作為一個發(fā)展中的人口大國，由于人們衛(wèi)生意識和醫(yī)療條件的限制，牙齒缺失的發(fā)生率在人群中相當高。由于目前的各種修復方法存在種種弊端，因此，如何使牙齒再生，一直是口腔醫(yī)學研究者們追逐的夢想。近年來，隨著組織工程、干細胞等技術的不斷進步，我們離擁有“第三副牙齒”的夢想也越來越近了。在構建組織工程牙齒過程中，礦化能力已成為種子細胞能否成功

2、形成牙體硬組織的關鍵因素。學者們不斷探索牙齒生物礦化的調(diào)控機制。然而，到目前為止，我們對牙齒發(fā)育過程中的礦化調(diào)控機制尚未完全了解。
　　 生物礦化過程是一個精密調(diào)控的生理過程。Mann等人認為生物體內(nèi)的礦化過程可分為三個階段:
　　 (1)超分子預組裝(Supramolecular Preorganization):在礦物沉積前構造出一個高度有序的反應環(huán)境，該環(huán)境決定了無機礦物成核的位置。
　　 (2)分子界面識

3、別(Interfacial Molecular Recognition):在已形成的超分子框架的控制下，無機礦物質(zhì)于無機/有機界面處自溶液中成核。
　　 (3)細胞調(diào)控(Cellular Processing):已形成的礦物晶核在超分子框架的控制下繼續(xù)生長，在細胞的參與下組裝成高級結構，其中生物礦物晶體被賦予了獨特的結構和形態(tài)，并產(chǎn)生了復雜的微結構和超微結構組織。
　　 人體中的硬組織，如牙齒、骨骼，都是生物礦化過程的產(chǎn)

4、物。在生理條件下，通過細胞的參與、調(diào)節(jié)，各種生物活性因子有序作用，人體生成了具有特殊形態(tài)和功能的硬組織（礦化組織）。而在體外利用物理或化學的方法，合成類似的礦化物則需要相當苛刻的條件。因此，生理條件下的礦化，細胞和各種生物活性因子的調(diào)控是起到?jīng)Q定性作用的。但如何在體外條件下重現(xiàn)細胞及各種生物活性因子的調(diào)控作用，一直是生物礦化研究領域密切關注并亟待解決的問題。
　　 自2000年發(fā)現(xiàn)牙髓干細胞以來，學者對其展開了深入研究，以牙髓干

5、細胞為模型尋找促進礦化的方法，探討礦化機制。從牙髓中分離培養(yǎng)的成體干細胞在體外和支架材料復合后，移植到動物體內(nèi)，已成功獲得了類似牙髓—牙本質(zhì)復合體的結構。到目前為止，學者們對牙髓干細胞的研究主要集中于正常牙髓干細胞，然而，在體牙髓干細胞形成修復性牙本質(zhì)是當牙齒受到磨損、齲損等慢性刺激的情況下發(fā)揮作用的，那么深齲下牙髓干細胞的生物學特性有何改變，發(fā)生這種變化的原因何在呢？
　　 蛋白質(zhì)組學是近年來發(fā)展起來的在生命科學乃至自然科學領

6、域最活躍的學科。本課題從正常牙髓干細胞和深齲牙髓干細胞的生物學差異出發(fā)，利用高通量的雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)學策略，篩選與礦化相關的蛋白，并對該蛋白的功能進行驗證，研究結果為探索牙髓干細胞的礦化機制及尋找礦化標記物提供了理論依據(jù)。
　　 本論文主要包括以下四章內(nèi)容:
　　 第一章:深齲牙髓干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 本章實驗主要比較組織塊法、酶消化法、及改良組織塊酶消化法分別分離培養(yǎng)8例共24例深齲牙髓

7、干細胞，并利用正常牙髓干細胞做對照，結果表明組織塊法、酶消化法及改良組織塊酶消化法均可以培養(yǎng)出人齲壞牙髓干細胞。改良組織塊酶消化法采用蓋玻片輕壓組織塊的方法，保證組織塊能牢固的貼附于孔板上，經(jīng)酶消化的組織塊變得松散，有利于培養(yǎng)液滲透到組織塊內(nèi)，顯微鏡下觀察組織塊透光性好，有利于細胞從組織塊內(nèi)游出，本實驗證明利用改良組織塊酶消化法將正常和深齲牙髓組織接種4、5天后即有細胞從組織塊內(nèi)游出，并且可以形成明顯的細胞暈，可以培養(yǎng)出狀態(tài)良好的深齲牙

8、髓干細胞。改良組織塊酶消化法保證了在較短的時間內(nèi)獲得大量的細胞，是一種理想的原代培養(yǎng)方法，為我們后續(xù)研究奠定了實驗基礎。
　　 第二章:正常與深齲牙髓干細胞生物學特性的比較
　　 為了比較正常和深齲牙髓干細胞生物學特性的差異，我們利用MTT、流式細胞儀及檢測克隆形成能力的方法比較了兩種細胞增殖能力的差異;礦化誘導液誘導正常和深齲牙髓干細胞后，比較兩者形成礦化結節(jié)的能力，堿性磷酸酶試劑盒檢測ALP活性，qRT-PCR檢測成

9、骨相關基因的表達。結果表明，深齲牙髓干細胞較正常牙髓干細胞表現(xiàn)出了較強的增殖能力。經(jīng)礦化誘導后深齲牙髓干細胞形成礦化結節(jié)的能力強于正常牙髓干細胞，同時也表現(xiàn)出了較強的ALP活性;qRT-PCR結果表明深齲牙髓干細胞內(nèi)成骨成牙標記物的表達量較正常牙髓干細胞顯著增高。
　　 第三章:深齲牙髓干細胞的蛋白質(zhì)組學分析
　　 為了更好的理解牙髓干細胞的礦化機制，尋找深齲牙髓干細胞與正常牙髓干細胞產(chǎn)生生物學特性差異的原因，本實驗運用

10、熒光雙向差異凝膠電泳對正常和深齲牙髓干細胞進行電泳分析，軟件分析正常和深齲牙髓干細胞蛋白表達譜發(fā)現(xiàn)20個蛋白質(zhì)斑點在兩組凝膠中有顯著性表達差異，其中有10個在深齲牙髓干細胞中表達上調(diào)，10個在深齲牙髓干細胞中表達下調(diào)。利用質(zhì)譜技術鑒定的相關蛋白，采用免疫印跡對篩選的部分差異蛋白(TCP-1，Stathmin)進行驗證。并探討候選蛋白在參與礦化過程可能發(fā)揮的作用。
　　 第四章:Stathmin蛋白生物學作用的基本機制探討

11、　　 Stathmin是本實驗篩選的礦化相關蛋白之一，又稱p17，p18，p19，Op18，19K，Op18/Stathmin Metablastin等，是近年來發(fā)現(xiàn)的在序列上高度保守的，在細胞的增殖和分化中十分重要的可溶性微管輔助蛋白。Stathmin由149個氨基酸組成，分子量19kD，pH515～612，有兩個不同的亞型α/β。蛋白質(zhì)組學篩選并鑒定Stathmin在正常牙髓干細胞中表達上調(diào)，目前關于其對牙髓干細胞生物學特性的影響

12、尚未見報道。為了探討Stathmin對牙髓干細胞生物學特性的影響，我們構建了Stathmin過表達和表達抑制的載體，并轉染到正常牙髓干細胞內(nèi)，qRT-PCR驗證過表達及沉默效率。過表達Stathmin后牙髓干細胞形成礦化結節(jié)的能力顯著增強，表達成骨相關基因(BSP、RUNX2、OCN)的量也較對照組顯著增強;沉默Stathmin后牙髓干細胞形成礦化結節(jié)的能力顯著減弱，同時可以下調(diào)成骨相關基因的表達。綜合以上結果Stathmin對牙髓干細

13、胞的礦化能力具有一定調(diào)控作用，并呈正相關，本實驗為揭示牙髓干細胞礦化機制，促進牙髓干細胞礦化能力提供新的思路。
　　 材料方法:
　　 牙髓干細胞的分離培養(yǎng):
　　 標本取自南方醫(yī)院口腔頜面外科，收集臨床18-22歲患者因阻生而拔除的健康、完整的智齒為正常組，有深齲，剩余牙本質(zhì)厚度約2mm，無自發(fā)痛等牙髓炎癥狀的智齒為深齲組（經(jīng)患者本人及家屬知情同意），牙齒拔除后置于PBS緩沖液內(nèi)送至實驗室，沿釉牙骨質(zhì)界用高速手

14、機環(huán)繞牙頸部磨出一定深度的溝槽，注意不能穿髓。在超凈臺內(nèi)將牙齒沿溝槽劈開，無菌條件下取出牙髓（去除根尖孔端約2mm的牙髓）置于PBS緩沖液內(nèi)。反復漂洗至少3次，對于深齲牙髓組織至少漂洗5次。
　　 細胞增殖能力的檢測:
　　 流式鑒定細胞周期:
　　 收集5×105/mL正常牙髓干細胞和深齲牙髓干細胞，根據(jù)實驗步驟，流式細胞儀上機，行細胞周期檢測、分析。
　　 MTT法檢測細胞增殖情況:
　　 取

15、對數(shù)生長期的第3代細胞，將正常牙髓干細胞和深齲牙髓干細胞以5×103/孔的密度接種于96孔板，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm波長下各孔光吸收值，求均值。
　　 克隆形成實驗:
　　 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整每組細胞密度至10～15個/mL，吹打混勻，接種子96孔板內(nèi)，常規(guī)倒置顯微鏡下觀察克隆形成情況，21d后甲苯胺藍染色并計算形成克隆數(shù)（以≥50個細胞為一個克?。?。
　　 堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化誘導:

16、
　　 為了比較細胞ALP水平變化情況，將正常牙髓干細胞和深齲牙髓干細胞分別按5×103個/孔接種于96孔板內(nèi)，按照ALP試劑盒說明操作，檢測各組細胞的ALP活性，空白孔調(diào)零，檢測520 nm下各孔吸光度(OD)值，檢測細胞的ALP活性。正常牙髓干細胞和深齲牙髓干細胞的單細胞懸液以1×104細胞/孔接種于24孔板，茜素紅染色法鑒定礦化結節(jié)。
　　 雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì):
　　 正常和深齲牙髓干細胞熒光雙向凝膠電

17、泳，等點聚焦電泳和SDS-PAGE凝膠電泳，質(zhì)譜分析，文獻回顧篩選相關蛋白，免疫印跡驗證。
　　 qRT-PCR:
　　 抽提細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA后，采用sybgreen法進行PCR擴增，通過相對定量以2-△△ct值代表基因的相對表達強度。
　　 Western blot:
　　 抽提細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白濃度測定，10％ SDS-PAGE電泳、轉膜、免疫雜交、顯影及定影，蛋白相對表

18、達強度采用Quantity One軟件進行定量。
　　 病毒獲取:
　　 過表達Stathmin慢病毒表達載體:以正常人外周血為模板，擴增Stathmin目的基因，并將其連接到GV261載體，包裝細胞用:293T細胞，獲得充足質(zhì)粒GV261-Stathmin。
　　 沉默Stathmin慢病毒表達載體為pGLV-H1-GFP+Puro，包裝系統(tǒng)為PGPackaging Plasmid Mix，包裝細胞:293T細

19、胞，由上海吉瑪制藥技術有限公司包裝。
　　 細胞轉染:
　　 慢病毒感染:將慢病毒懸液按照不同的病毒感染復數(shù)感染正常牙髓干細胞，48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(green fluorescent protein，GFP)發(fā)光情況。鑒于慢病毒感染效率較高，以GFP為標記，利用流式細胞儀進行細胞分選獲得GFP陽性細胞，分別建立過表達Stathmin、穩(wěn)定干擾Stathmin的正常牙髓干細胞。
　　 統(tǒng)計學分析:

20、r>　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，MTT、ALP采用重復測量的方差分析，檢測沉默Stathmin的qRT-PCR采用單因素方差分析，正常和深齲牙髓干細胞克隆形成率、qRT-PCR檢測正常和深齲牙髓干細胞礦化相關基因時采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，其他涉及到兩組數(shù)據(jù)比較均采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.深齲牙髓干細胞的生物學特性
　　

21、 本實驗利用酶消化法、組織塊法、組織塊酶消化法均可分離培養(yǎng)出深齲牙髓干細胞，但改良組織塊酶消化可以在短時間內(nèi)獲得大量細胞，是一種較好的原代培養(yǎng)方法。流式細胞儀檢測間充質(zhì)干細胞標記物的表達，與正常牙髓干細胞相比，深齲牙髓干細胞表達間充干細胞標記物(Stro-1、CD90、CD105)的含量顯著增高，表明深齲牙髓干細胞較正常牙髓干細胞有更強的干細胞特性(Stro-1: t=3.325, P=0.029; CD90: t=4.446, P=

22、0.011; CD105: t=3.411, P=0.027)。將兩種牙髓干細胞三向誘導，結果表明正常和深齲牙髓干細胞均具有成脂成骨及成軟骨的能力，且深齲牙髓干細胞形成礦化結節(jié)的能力的強于正常牙髓干細胞。
　　 為了比較兩種細胞的增殖能力，本實驗分別采用MTT、細胞周期、及檢測細胞克隆形成能力的方法，從三方面比較正常和深齲牙髓干細胞增殖能力的差異。MTT結果顯示從第3天開始深齲牙髓干細胞較正常牙髓干細胞表現(xiàn)出較高的OD值，通過7

23、天的比較，結果表明深齲牙髓干細胞較正常牙髓干細胞具有較強的增殖能力（F=7.350，P=0.000）;細胞周期顯示深齲牙髓干細胞G2M+S期細胞比例高于正常牙髓干細胞;同時深齲牙髓干細胞較正常牙髓干細胞表現(xiàn)出了較強的克隆形成能力(t=9.798，P=0.001)。
　　 為了比較兩種細胞的礦化能力，將正常和深齲牙髓干細胞分別礦化誘導，誘導后深齲牙髓干細胞形成礦化結節(jié)的能力強于正常牙髓干細胞，同時深齲牙髓干細胞也表現(xiàn)出了較強的AL

24、P活性(t=191.741，P=0.000）;qRT-PCR結果表明深齲牙髓干細胞內(nèi)成骨成牙標記物OCN(t=3.989，P=0.003)、RUNX2(t=3.588，P=0.005)、ALP(t=6.044, P=0.000)、Osteonetin(t=2.270, P=0.047)、DSPP(t=-3.094，P=0.011)、BSP(t=5.847，P=0.000)的表達量較正常牙髓干細胞顯著增高。
　　 2.深齲牙髓干細

25、胞蛋白質(zhì)組學及候選蛋白的生物學特性
　　 熒光雙向差異凝膠電泳分析正常和深齲牙髓干細胞差異表達蛋白，質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)20個蛋白質(zhì)斑點在兩組凝膠中有顯著性表達差異，其中有10個在深齲牙髓干細胞中表達上調(diào)，10個在深齲牙髓干細胞中表達下調(diào)。并采用免疫印跡對篩選的部分差異表達蛋白進行驗證，經(jīng)文獻回顧發(fā)現(xiàn)Stathmin與礦化關系密切。因此，我們構建了Stathmin過表達和表達抑制載體，并轉染到正常牙髓干細胞內(nèi)，結果表明上調(diào)Stathm

26、in的表達可以增強牙髓干細胞形成礦化結節(jié)的能力及顯著上調(diào)成骨相關基因BSP(t=-3.179，P=0.034)、OCN(t=-4.104，P=0.015)、RUNX2（t=-3.565，P=0.023）的表達;下調(diào)Stathmin在牙髓干細胞內(nèi)的表達后牙髓干細胞形成礦化結節(jié)的能力下降，同時顯著下調(diào)成骨相關基因BSP(t=7.736,P=0.002)、OCN(t=3.670,P=0.021)、RUNX2(t=3.309, P=0.030)