1、本研究以比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究思想為理論指導(dǎo)，選擇膽固醇結(jié)石患者和正常人膽囊壁組織蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，應(yīng)用2-DE及MALDI-TOF/TOF MS作為研究手段，預(yù)期可以發(fā)現(xiàn)一些新的在膽固醇結(jié)石形成中占重要作用蛋白質(zhì)，通過相應(yīng)的鑒定和生物學(xué)功能驗(yàn)證，為我們進(jìn)一步深入揭示人類膽固醇結(jié)石形成的分子遺傳機(jī)制及篩選特異性診斷標(biāo)志物提供一定的理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
第一部分人膽囊全層組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜的建立
目的建立、優(yōu)化膽固醇結(jié)石病人
2、與正常人膽囊組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，用于膽囊組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為探討膽石成因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法提取膽固醇結(jié)石患者和正常人膽囊壁組織總蛋白，構(gòu)建相應(yīng)的雙向電泳蛋白質(zhì)表達(dá)譜，應(yīng)用ImageMaster圖像分析軟件獲得差異蛋白點(diǎn)信息。結(jié)果膽固醇結(jié)石患者與正常人膽囊壁總蛋白濃度分別為7.45 mg/mL和4.36 mg/ml(P<0.01)。兩組樣本均獲得分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，膽固醇結(jié)石病人組與正常組內(nèi)蛋白質(zhì)平均匹配點(diǎn)數(shù)分別為6
3、32±61和606±64，各匹配率分別為73.46％和71.49％。組間蛋白質(zhì)平均匹配點(diǎn)為474，匹配率為70.64％。膽固醇結(jié)石病人的27個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，與正常人間蛋白表達(dá)差異明顯(P<0.05)。結(jié)論初步建立了膽固醇結(jié)石病人與正常人膽囊組織的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，分析兩者間差異蛋白點(diǎn)，為膽石成因研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
第二部分人膽囊漿膜下組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
目的建立、優(yōu)化人膽囊壁漿膜層組織的蛋白質(zhì)表
4、達(dá)譜和人膽囊壁漿膜下層組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)，比較分析膽固醇結(jié)石患者與正常人膽囊壁漿膜下組織蛋白表達(dá)譜的差異，通過質(zhì)譜技術(shù)篩選漿膜下層組織差異表達(dá)蛋白。方法提取膽固醇結(jié)石患者和正常人膽囊壁漿膜層和漿膜下組織總蛋白，構(gòu)建相應(yīng)的雙向電泳蛋白質(zhì)表達(dá)譜，應(yīng)用ImageMaster圖像分析軟件獲得差異蛋白點(diǎn)信息，質(zhì)譜鑒定漿膜下層差異表達(dá)蛋白質(zhì)。結(jié)果膽固醇結(jié)石病人與正常人的膽囊漿膜層和漿膜下層組織差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜均獲得分辨率高、重復(fù)性好的雙向
5、電泳圖譜，漿膜下層組織差異表達(dá)譜結(jié)果顯示19個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者之間差異較大，質(zhì)譜成功鑒定11個(gè)蛋白，1個(gè)重復(fù)。其中Tropomyosin4，Transgelin，Transthyretin，Cyanomet Rhb1.1，Haptoglobin-related protein precursor在結(jié)石組中表達(dá)上調(diào)，Myosin，Peroxiredoxin3，Hypothetical protein，T cell receptor alpha
6、 chain在結(jié)石組中表達(dá)下調(diào)。結(jié)論初步建立了膽固醇結(jié)石病人與正常人膽囊漿膜層與漿膜下層組織的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，對(duì)漿膜下層組織分析并成功鑒定差異蛋白點(diǎn)，為膽固醇結(jié)石形成的關(guān)鍵調(diào)控蛋白質(zhì)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
第三部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)的再驗(yàn)證
目的對(duì)漿膜下層組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行再驗(yàn)證，以保證初篩結(jié)果的可信度及進(jìn)一步功能學(xué)研究的確定性。方法通過Western Blotting和RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證TTR
7、、SM22-alpha、TPM4、Prx3這4種差異表達(dá)蛋白在膽固醇結(jié)石患者和正常人的膽囊組織中的表達(dá)情況。結(jié)果Western Blotting證實(shí)TTR、SM22-alpha、TPM4在膽固醇結(jié)石患者膽囊壁中較正常對(duì)照組上調(diào)，RT-PCR證實(shí)SM22-alpha在結(jié)石組中表達(dá)上調(diào)，Prx3則表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 Western Blotting和 RT-PCR對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的再驗(yàn)證結(jié)果表明我們使用的2-DE、ImageMaster2D P
8、latinum5.0 software分析、質(zhì)譜鑒定等比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和結(jié)果可靠性。
第四部分運(yùn)甲狀腺素蛋白促成核功能的初步研究
目的觀測TTR在體外模擬膽汁體系中的成核活性。方法構(gòu)建Small和綜合模擬膽汁體系，運(yùn)用Holan觀測成核時(shí)間法，探討TTR的促成核效應(yīng)。結(jié)果 TTR組的成核時(shí)間在Small模擬膽汁體系中平均為(14.5±1.29)d，綜合模擬膽汁體系中平均為(13.5±0.58
9、)d，TTR可以促進(jìn)膽固醇結(jié)石成核、結(jié)晶。結(jié)論在體外模擬膽汁體系中TTR具有促成核活性，為進(jìn)一步研究其在膽固醇結(jié)石發(fā)病機(jī)制中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
綜上所述，本課題通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立了膽固醇結(jié)石組和正常對(duì)照組的膽囊組織、漿膜層組織、漿膜下層組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，對(duì)漿膜下層組織篩選、成功鑒定出差異蛋白質(zhì)點(diǎn)11個(gè)，重復(fù)1個(gè)，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)和RT-PCR方法進(jìn)行了TTR、SM22-alpha、TPM4、Prx3四種