復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病復(fù)發(fā)途徑及菌株基因型分析.pdf

1、外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是由念珠菌(Candida spp.)引起的一種常見的外陰陰道炎，75％的生育年齡女性一生中至少會(huì)患一次VVC，讓人擔(dān)憂的是VVC患者中40％-50％會(huì)反復(fù)發(fā)作。根據(jù)疾病的發(fā)作頻率和臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度，醫(yī)學(xué)工作者們將VVC劃分為單純性VVC（輕度和中度）和復(fù)雜性VVC(包括一年中發(fā)作4次及以上的復(fù)發(fā)性VVC(recurrent vulvovaginal ca

2、ndidiasis，RVVC)、重度VVC、非白色念珠菌感染的VVC、糖尿病及妊娠合并的VVC以及其他免疫疾病的VVC患者）。全球約5％-8％的婦女遭受RVVC的困擾，這種反復(fù)發(fā)作又經(jīng)久不愈的疾病特點(diǎn)，嚴(yán)重干擾了婦女的身心健康。
　　 RVVC的發(fā)病與多種因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確;但究其病因可歸因于宿主與致病菌兩方面因素。目前，對(duì)于這兩方面的研究均能見到不少的報(bào)告且研究方向各不相同。近幾十年的動(dòng)物及臨床研究結(jié)果均有顯

3、示:適應(yīng)性免疫可能不是主要的保護(hù)免疫機(jī)制，天然性免疫被認(rèn)為是粘膜念珠菌感染的主要防御機(jī)制。對(duì)于致病菌而言，致病菌的來源及致病菌本身的致病能力成為大家研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)。
　　 對(duì)于引起RVVC反復(fù)發(fā)作的致病菌源，各國學(xué)者仍有爭議，不同的研究顯示出不同的研究結(jié)果，可能是因?yàn)樯诚到y(tǒng)的特殊性及念珠菌在人體各器官的廣泛定植造成了外陰陰道假絲酵母菌感染源的復(fù)雜性。目前對(duì)于RVVC復(fù)發(fā)的感染源主要存在三方面的假說:
　　 1.陰道內(nèi)

4、源性感染:念珠菌作為陰道微環(huán)境的正常菌群之一，無癥狀正常人群帶菌率為5-10％。對(duì)分離自健康人群同一個(gè)體的不同解剖部位和不同個(gè)體同一解剖部位的白色念珠菌進(jìn)行基因型分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一個(gè)體不同解剖部位的菌株基因型明顯不同，而不同個(gè)體同一解剖部位的菌株基因型相同或相似。國外學(xué)者對(duì)復(fù)發(fā)性VVC患者在連續(xù)兩次發(fā)作期間從不同解剖部位分離出的白念珠菌進(jìn)行了生物學(xué)分型和基因分型顯示大多數(shù)VVC的復(fù)發(fā)是內(nèi)源性的。在美國愛荷華地區(qū)甚至發(fā)現(xiàn)了一株陰道專性

5、定植的菌株。我國學(xué)者白鳳彥教授從分子遺傳學(xué)方面解釋了白色念珠菌基因型與菌株的定植部位有關(guān)，定植部位的微環(huán)境對(duì)定植其中的菌株有選擇性，陰道來源菌株具有陰道特異性。國外研究發(fā)現(xiàn)VVC患者經(jīng)抗真菌治療后緊接著行陰道分泌物真菌檢測(cè)20-25％的女性念珠菌感染陰性，但在治療后30天再次行檢測(cè)時(shí)絕大部分患者再次表現(xiàn)為陽性;并且治療前后兩次急性發(fā)作的致病念珠菌菌種超過2/3是一致的。這些殘留的低濃度菌株很有可能導(dǎo)致下一次的繼續(xù)復(fù)發(fā)。正常無癥狀帶菌人群

6、與陰道炎患者陰道來源的白色念珠菌基因型分析發(fā)現(xiàn)，兩組菌群基因型分布具有相似性，提示VVC的發(fā)生主要是陰道內(nèi)源性的感染。有學(xué)者提出子宮內(nèi)膜可能是念珠菌的一個(gè)存儲(chǔ)池，隨著月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的脫落而引起感染，但目前沒有任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持該論點(diǎn)。
　　 2.消化系統(tǒng)來源:念珠菌作為條件性致病菌寄生于口腔、胃腸道及陰道等部位的粘膜皺褶，研究者提出肛門可以成為陰道念珠菌定植的最初來源，并且通過對(duì)直腸分離的念珠菌和陰道分離的念珠菌進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)兩處

7、來源菌株具有一致性的特點(diǎn)，提出腸道是念珠菌陰道炎感染致病菌的持久存儲(chǔ)器。而近期國內(nèi)外對(duì)念珠菌基因型分析發(fā)現(xiàn)同一患者生殖器及其他部位分離出的白念珠菌基因型分布具有明顯差異。
　　 3.性傳播:白色念珠菌也是男性生殖器念珠菌感染的主要病原菌。關(guān)于性交或其他性活動(dòng)是否可引起念珠菌的交叉感染的問題一直沒有定論，我國一直以來都未將生殖器念珠菌病歸在性病的范疇。對(duì)RVVC的研究發(fā)現(xiàn)男性至少有一個(gè)部位分離株的Ca3類型與其對(duì)應(yīng)女性外陰陰道分離

8、株的類型高度相似或完全相同，且RVVC患者及其無癥狀性伴侶不同解剖部位的念珠菌分析發(fā)現(xiàn)大部分無癥狀性伴侶身上都能夠找到與RVVC患者致病菌株基因型相同的菌株。有研究表明VVC患者無癥狀性伴侶生殖器攜帶念珠菌是非VVC患者性伴侶的4倍。RVVC患者性伴侶中20％的人存在陰莖念珠菌感染，且感染的菌株相同，男性念珠菌性龜頭炎來源的致病菌株的基因型的分布與女性念珠菌性陰道炎致病菌株的分布特點(diǎn)非常相似，都具有相同的優(yōu)勢(shì)基因型。從另一個(gè)方面提示，男

9、性生殖器致病白色念珠菌與女性陰道炎致病念珠菌存在性傳播的可能。但Shihadeh等則認(rèn)為對(duì)于性伴侶的治療不會(huì)影響RVVC治愈率和復(fù)發(fā)率。
　　 隨著念珠菌分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，從基因水平探討白色念珠菌致病性與疾病類型的關(guān)系成為趨勢(shì)。不同國家和地區(qū)的研究者們針對(duì)白色念珠菌的基因型進(jìn)行了大量的工作。從菌株指紋分析開始，限制性片段長度多態(tài)性分析和微衛(wèi)星序列分析的采用，使白色念珠菌基因分型的方法不斷取得突破。其中微衛(wèi)星序列多態(tài)性分析方法

10、是一種基于PCR擴(kuò)增的DNA指紋圖譜分析方法。微衛(wèi)星即末端短片段重復(fù)序列(short tandem repeats， STR)或短片段重復(fù)序列(shortsequence repeats，SSR)，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（多數(shù)為2-4個(gè)）為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。微衛(wèi)星寡核苷酸的重復(fù)次數(shù)在同一物種的不同菌株間存在很大差異，因此微衛(wèi)星標(biāo)記可用于菌株分子分型的研究。Sampaio等(2003，2005)報(bào)道的四號(hào)染色體的非編碼區(qū)的微衛(wèi)星

11、序列CAI有高度多態(tài)性，通過對(duì)其進(jìn)行基因掃描，可以達(dá)到0.97的分辨率，是迄今為止單位點(diǎn)分析所能達(dá)到的最大的分辨率。而單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand ConformationPolymorphism，SSCP)技術(shù)其理論基礎(chǔ)是單鏈DNA具有序列特異性的二級(jí)或三級(jí)構(gòu)象，1個(gè)或多個(gè)堿基的變異能影響其構(gòu)象，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，構(gòu)象的改變表現(xiàn)為單鏈DNA遷移率的改變。因此，把雙鏈DNA片段在加熱或變性劑的作用下生成單鏈，在

12、非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，根據(jù)各樣品的單鏈遷移率，就可以把突變體和非突變體區(qū)分開，從而達(dá)到分離菌株的目的，具有高靈敏性，將SSCP引入CAI區(qū)的基因型分析，并結(jié)合GeneScan技術(shù)，對(duì)大樣本臨床來源致病白色念珠菌的基因型分析具有經(jīng)濟(jì)、方便而精確的優(yōu)勢(shì)。
　　 綜上，RVVC感染源是陰道內(nèi)源性的復(fù)發(fā)或還是外源性的感染，性傳播是否是RVVC患者發(fā)病和復(fù)發(fā)的重要傳播途徑。國內(nèi)外研究存在分歧。本研究通過分析RVVC患者多次急性發(fā)病的

13、致病念珠菌菌種分布特點(diǎn)，以及RVVC、單純VVC、正常人群來源念珠菌的基因分布特點(diǎn)，旨在從病原學(xué)方面進(jìn)一步探討RVVC復(fù)發(fā)途徑及白色念珠菌基因型與RVVC復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　 研究目的:
　　 研究通過觀察RVVC患者多次急性發(fā)作期陰道分泌物念珠菌菌種分布，明確RVVC患者多次發(fā)病的主要致病菌，并通過分析同一病人多次發(fā)病白色念珠菌基因型的分布特點(diǎn)，了解RVVC發(fā)病原因及臨床癥狀的嚴(yán)重程度與白色念珠菌基因型是否存在聯(lián)系，從病

14、原學(xué)方面進(jìn)一步探討RVVC復(fù)發(fā)途徑及白色念珠菌基因型與RVVC復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　 材料和方法:
　　 1.研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn):年齡18-50歲之間的婦女，平均年齡32.5歲。孕婦、糖尿病、免疫缺陷及長期服用抗生素的人群不納入研究對(duì)象。
　　 RVVC的診斷標(biāo)準(zhǔn):1年中發(fā)作VVC＞=4次，就診陰道分泌物涂片念珠菌陽性。2009年10月至2010年9月珠江醫(yī)院婦科門診就診，信息符合納入標(biāo)準(zhǔn)的80名RVVC、66名VV

15、C患者，進(jìn)行急性期陰道分泌物念珠菌的分離。同時(shí)對(duì)2010年6-8月我院體檢中心體檢的無臨床癥狀體征，陰道分泌物鏡檢陰性的298位健康婦女行陰道分泌物的培養(yǎng)，分離念珠菌。對(duì)于RVVC患者進(jìn)行規(guī)范治療及后期隨訪，患者再次發(fā)病時(shí)再次進(jìn)行陰道致病菌的分離培養(yǎng)，記錄RVVC患者每次復(fù)發(fā)的相應(yīng)資料。
　　 參照2004年中華婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)感染性疾病協(xié)作組關(guān)于外陰、陰道念珠菌病診治規(guī)范中評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)RVVC每次急性發(fā)病期、單純VVC患者急性發(fā)病期

16、臨床癥狀的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。
　　 2.用無菌棉簽取患者陰道側(cè)壁分泌物，將陰道分泌物涂10％KOH溶液懸滴鏡檢，高倍鏡鏡檢可見菌絲或孢子。將新鮮標(biāo)本直接接種于加有氯霉素的YPD富集液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至液體渾濁，將渾濁的菌液涂布于沙保弱固體平板培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48-72小時(shí)后取出觀察，見乳酪樣菌落生長，挑選單菌落劃線培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基，經(jīng)過3次反復(fù)分離純化后，再挑選單菌落接種于YPD固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化。
　　 3.菌種鑒

17、定:通過形態(tài)學(xué)初步鑒定菌種類別，再利用酶消化法提取念珠菌總DNA，經(jīng)過ITS1區(qū)PCR產(chǎn)物的SSCP圖譜分析，對(duì)具有代表性的菌株進(jìn)行ITS序列或D1/D2序列PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與EMBL/DDBJ/GenBank中的已知念珠菌序列相比對(duì)，確定菌株種屬。
　　 4.白色念珠菌基因型分析;所有測(cè)序后明確為白色念珠菌的菌株行CAI區(qū)序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP電泳分析，將具有不同SSCP圖譜的菌株用熒光

18、標(biāo)記的CAIF引物（5’端用6-carboxyfluorescein標(biāo)記）和CAIR引物重新擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在ABI370分析儀上進(jìn)行電泳，然后用GeneScan3.7分析軟件自動(dòng)分析片段的大小，以菌株ATCC90028的CAI兩個(gè)等位基因位點(diǎn)重復(fù)片段數(shù)(27-38)為標(biāo)準(zhǔn)，確定待測(cè)白色念珠菌菌株的CAI基因型。
　　 5.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間各菌種的構(gòu)成比差異比較、VVC患者臨床癥狀與致病菌株種類

19、、基因型種類的比較以及RVVC患者、偶發(fā)VVC患者及無癥狀帶菌者中致病菌優(yōu)勢(shì)基因型及非優(yōu)勢(shì)基因型分布差異的組間比較采用x2檢驗(yàn);若有理論數(shù)小于5則采用校正卡方檢驗(yàn);計(jì)量資料組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn);以上檢驗(yàn)均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.RVVC患者、偶發(fā)VVC患者及無癥狀正常人群陰道分泌物念珠菌培養(yǎng)陽性率分別為100.0％、100％、9.7％，RVVC患者陰道分泌物培養(yǎng)菌株132株，白色念

20、珠菌89株(67.4％)，光滑念珠菌38株(28.0％)，近平滑念珠菌2株(1.5％)，季也蒙畢赤念珠菌1株(0.8％)，C.nivariensis2株(1.5％)，Issatchenkia orientalis1株(0.8％)。其中，RVVC組包含36名重復(fù)取樣2-4次的標(biāo)本。偶發(fā)VVC患者陰道分泌物培養(yǎng)菌株66株，其中白色念珠菌51株(77.3％)，光滑念珠菌14株(21.2％)，熱帶念珠菌1株(1.5％)。正常人群陰道分泌物培養(yǎng)菌

21、株29株，其中白色念珠菌13株(44.8％)，光滑念珠菌13株(44.8％)，熱帶念珠菌1株(3.4％)，近平滑念珠菌2株(6.9％)。三組人群中白色念珠菌與非白色念珠菌所占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.653，P=0.008)，白色念珠菌仍是RVVC及偶發(fā)VVC的主要致病菌，但RVVC患者與偶發(fā)VVC患者陰道來源白色念珠菌與非白色念珠菌所占比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=2.060，P=0.151)。
　　 2.三組人群來源的1

22、53株白色念珠菌，CAI區(qū)序列分析共獲得38種CAI基因型，陰道炎來源的140株白色念珠菌最常見的基因型為CAI30-45(45株，占32.1％)、CAI32-46（23株，占16.4％），同時(shí)發(fā)現(xiàn)與這兩種基因型非常接近的并且在CAI片段上只相差1～2個(gè)三堿基片段的重復(fù)，即基因型為30～32-43～47，共占66.0％，呈明顯優(yōu)勢(shì)分布;與正常人群來源優(yōu)勢(shì)基因型比例23.1％（3/13株）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.676，P=0.002

23、)。其中RVVC患者來源菌株中優(yōu)勢(shì)基因型所占比例為（64/89株）72.0％，偶發(fā)VVC患者來源菌株優(yōu)勢(shì)基因型所占比列為（34/51株）66.7％，兩者差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.424,P=0.515)。
　　 3.對(duì)36名確診為RVVC并且有一定隨訪條件的患者，進(jìn)行多次急性期取樣，6個(gè)RVVC患者進(jìn)行了3次急性發(fā)作期取樣，5個(gè)RVVC患者進(jìn)行來了4次的陰道分泌物取樣，其余各行2次急性發(fā)病期陰道分泌物菌株分離培養(yǎng)，共培養(yǎng)菌株

24、88株，非白色念珠菌21株，白色念珠菌67株;白色念珠菌CAI基因型共20種，其中30-45為23株(34.3％)，32-46為11株(16.4％)，32-47為7株(10.4％)，其他17中基因型多為1-3株。前后2次急性發(fā)作感染同種菌種的患者為28位，占77.78％(28/36)。其中兩次感染均為白色念珠菌的患者為25位，前后感染同一基因型白色念珠菌菌株的RVVC患者為19位(19/36=52.8％)，基因型30-45為8名，32-

25、46為4名，32-47為2名，其他各基因型為1名。
　　 4.198名陰道炎患者中（包括RVVC復(fù)發(fā)時(shí)看作新的研究對(duì)象），根據(jù)臨床癥狀嚴(yán)重程度評(píng)分結(jié)果，其中重度VVC95人，輕中度VVC103人。重度VVC患者來源的95株念珠菌，白色念珠菌59株(62.1％)，光滑念珠菌31株(32.6％)，近平滑念珠菌1株(1.0％)，熱帶念珠菌1株(1.0％)，其它3株(3.1％).輕中度VVC來源的103株念珠菌，白色念珠菌81株(78.

26、6％)，光滑念珠菌21株(20.4％)，近平滑念珠菌1株(0.9％)。重度VVC與輕中度VVC患者白色念珠菌及非白色念珠菌的感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.524，P=0.011)，非白色念珠菌在重度VVC患者中感染率增高。同時(shí)，對(duì)RVVC患者及偶發(fā)VVC患者臨床癥狀嚴(yán)重程度的比較中發(fā)現(xiàn)，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.496，P=0.481).
　　 5.59位重度VVC和81位輕中度VVC患者感染白色念珠菌，對(duì)其基因型

27、分布統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，重度VVC患者感染白色念珠菌基因型中，優(yōu)勢(shì)基因型.30-45和32-46分布為49.2％（30株）和13.6％（8株），而在輕中度VVC患者中，以上兩種基因型菌株依次為（15株，18.5％）和(15株，18.5％)。同時(shí)，與30-45和32-46相差1-2個(gè)堿基的優(yōu)勢(shì)基因型菌株在重度VVC和輕中度VVC患者中分別為14株和16株，兩組人群優(yōu)勢(shì)基因型白色念珠菌分別占88.1％(52/59)和56.8％(46/81)，兩組差異

28、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=15.971，P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1.導(dǎo)致我國外陰陰道假絲酵母菌病的主要致病菌仍為白色念珠菌;但非白色念珠菌的比例有所升高。
　　 2.陰道炎患者陰道來源的念珠菌基因型包含了正常無癥狀攜帶者陰道來源念珠菌的基因型，與其他研究者對(duì)人體其他部位定植念珠菌基因型不同，更能說明陰道炎的感染是內(nèi)源性的感染。
　　 3.陰道炎患者陰道來源的白色念珠菌基因型集中分布于30-45和

29、32-46，呈現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)基因型分布特點(diǎn)，說明白色念珠菌基因型與念珠菌陰道炎發(fā)病有關(guān)。
　　 4.同一RVVC多次急性復(fù)發(fā)存在感染相同菌種的趨勢(shì)，部分患者甚至是感染相同基因型的菌株，而大部分為優(yōu)勢(shì)基因型菌株，說明RVVC復(fù)發(fā)的感染源是來源于陰道內(nèi)的殘留致病菌，而且白色念珠菌基因型與RVVC復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　 5.外陰陰道假絲酵母菌病臨床嚴(yán)重程度與感染菌種的類型有關(guān)，非白色念珠菌種更容易導(dǎo)致重度VVC;白色念珠菌基因型與臨床癥狀