水稻稻瘟病抗性基因Pita2與白葉枯病抗性基因Xa31(t)物理圖譜的構建及候選基因驗證.pdf

1、水稻是世界上的主要糧食作物之一，水稻稻瘟病和白葉枯病是目前最嚴重的2種水稻病害。利用水稻宿主的抗性基因進行水稻抗性品種的培育來預防水稻病害是最經濟和環(huán)保的方式。但稻瘟病和白葉枯病病菌的群體變異頻繁，導致水稻抗性基因的抗病效果減弱甚至喪失。因此，需要對水稻抗病基因進行廣泛挖掘和深入研究以應對水稻抗性育種的需求。前期研究表明水稻稻瘟病廣譜抗病基因 Pita2和水稻白葉枯病廣譜抗性基因Xa31(t)都位于水稻染色體較復雜的區(qū)域，其目標區(qū)段與水

2、稻日本晴及9311的基因組比對都存在較大差異，不能通過常規(guī)的電子定位和LD-PCR等技術進行分離和克隆。因而我們構建了 Pita2供體品種 PiNo.4以及 Xa31(t)供體品種 ZCL的Fosmid文庫，并對其進行篩選、測序，對所得序列進行基因的預測，候選基因的遺傳轉化及功能驗證。
　　本研究主要內容包括：⑴通過優(yōu)化和改進實驗條件，建立了一種水稻種子基因組 DNA快速高效的提取方法。該方法在兩小時內可以提取384個樣品，PCR

3、擴增目的片段可以達到1.2 kb。應用該提取方法，成功準確高效的完成了對課題組自主培育的雜交稻駿優(yōu)522的純度鑒定。該方法簡單廉價高通量，可以滿足分子標記輔助育種、圖位克隆、聚合育種、種子純度鑒定等應用要求，在隨后抗性基因的研究中也得到了充分利用。⑵PiNo.4和ZCL的Fosmid文庫的平均插入片段為35 kb，其滴度分別為2.7×105 Cfu/lib與7.7×105 Cfu/lib，基因組覆蓋度均為8.2-11.7倍，隨機單克隆末

4、端測序顯示基本都為水稻基因組序列，菌體連續(xù)培養(yǎng)5代之后其重組質粒依然穩(wěn)定存在，以上結果表明：所構建的2個文庫均可以用于后期的文庫篩選。⑶在Pita2研究方面，通過對本課題組前期篩選出的分子標記的進一步驗證，挑選出8對特異性分子標記，進行 PiNo.4文庫的篩選，獲得覆蓋Pita2候選區(qū)域的3個Fosmid克隆，并構建了Pita2區(qū)域基于抗性親本PiNo.4的物理圖譜。從10個預測基因中挑選5個候選基因進行克隆及遺傳轉化。到目前為止5個候

5、選基因已經全部進行了遺傳轉化，其中3個候選基因（Pita2-seq4、Pita2-seq6、Pita2-seq9）的T0代轉基因植株已經進行了陽性鑒定；其余2個候選基因（Pita2-seq5、Pita2-seq8）正在進行轉基因植株的移栽。⑷在Xa31(t)研究方面，通過對本課題組前期篩選出的分子標記的進一步驗證，挑選出4對特異性分子標記進行 ZCL文庫的篩選，將覆蓋Xa31(t)候選區(qū)域的1個克隆進行測序，并進行基因的預測及功能分析。