水稻白葉枯病抗性基因Xa22(t)的克隆.pdf

1、由Xanthomonas oryzae pv.oryzae引起的白葉枯病嚴(yán)重危害水稻,可是國(guó)內(nèi)一直集中利用Xa3和Xa4兩個(gè)抗性基因,因而利用新的抗性基因改良現(xiàn)有品種的抗性日趨重要.云南地方粳稻扎昌龍(Zhachanglong,ZCL)對(duì)分別來(lái)自中國(guó)、菲律賓和日本的12個(gè)水稻白葉枯病菌表現(xiàn)抗性,對(duì)PXO61表現(xiàn)出的成株期抗性受Xa22(t)控制.已從明恢63中克隆的Xa26與Xa3可能是相同的基因,ZCL中含有Xa26相同的基因.(1)

2、目標(biāo)基因Xa22(t)的精細(xì)定位.構(gòu)建了7680個(gè)單株的由珍珠矮和扎昌龍配制的F<,2>群體,用兩個(gè)SSR標(biāo)記RM144和RM224篩選PXO61接種后的極端感病單株得到29個(gè)極端感病重組單株,目標(biāo)基因Xa22(t)與RM144和RM224分別有20個(gè)和9個(gè)極端感病重組.利用這些重組單株分析Xa22(t)區(qū)域的標(biāo)記,將Xa22(t)定位在明恢63-BAC克隆M3H8的亞克隆3/7A10和R1506之間,和這兩個(gè)標(biāo)記分別有2個(gè)和1個(gè)重組,

3、同時(shí)得到三個(gè)共分離的標(biāo)記M3H8-1、Sub11和X4-88.由于3/7A10是M3H8的亞克隆,并且R1506能和M3H8雜交,因而Xa22(t)定位在M3H8上.利用Xa26的序列檢索得到日本晴序列克隆AC116367,分析這個(gè)克隆發(fā)現(xiàn)抗病基因有關(guān)的序列信息很豐富,而且AC116367在目標(biāo)基因Xa22(t)區(qū)域,因而將AC116367作為目標(biāo)基因Xa22(t)的電子定位克隆.(3)確定候選基因及驗(yàn)證功能.對(duì)M3H8的兩個(gè)片段的序列

4、進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,SpeI可以將包含Xa26的19-kb片段切下來(lái),NheI可以將8-kb的LRR片段切下來(lái),AccI酶切片段可以覆蓋12-kb的LRR-Kinase.于是根據(jù)M3H8的序列,采用等位酶切法加收Z(yǔ)CL對(duì)應(yīng)大小的片段區(qū)域,克隆到合適載體上用特異引物篩選,再將得到的陽(yáng)性克隆的外源片段轉(zhuǎn)接到pCAMBIA1301,最后轉(zhuǎn)化到感病品種臺(tái)北309中來(lái)驗(yàn)證功能.(3)Xa22(t)區(qū)域相關(guān)片段的RT-PCR表達(dá)分析.對(duì)于Xa26內(nèi)的

5、兩對(duì)引物RkbL-2R和Rkb469-2145,在三個(gè)抗病材料ZCL(Xa22(t))、Wase Aikoku 3(WA3,攜帶Xa3)和IRBB4(Xa4)中組成型表達(dá),而在ZZA中沒(méi)有表達(dá),這可能與Xa26表現(xiàn)的抗病功能有關(guān).利用一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)RKORF1內(nèi)的幾對(duì)引物作RT-PCR表達(dá)分析,RKORF1在ZCL、WA3和IRBB4中組成型表達(dá),在ZCL和WA3中的表達(dá)相同,而在ZCL與IRBB4中的表達(dá)有差異,Xa22(t)區(qū)域可能具