抗AT-,1-受體胞外肽段抗體效應(yīng)與AT-,1-受體降壓疫苗研究.pdf

1、第一部分 難治性高血壓患者抗AT1受體自身抗體對(duì)VSMC胞漿游離鈣水平的影響 目的：觀察難治性高血壓患者血清中血管緊張素受體Ⅰ型(AT1受體)自身抗體對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)胞漿游離鈣水平的影響。 方法：應(yīng)用AT1受體的胞外第二環(huán)作為抗原，采用ELISA檢測(cè)22例難治性高血壓患者及24名非難治性高血壓患者血清中AT1受體自身抗體。應(yīng)用蛋白G親和柱提純

2、難治性高血壓患者血清中AT1受體自身抗體。用細(xì)胞免疫熒光染色方法檢測(cè)該抗體與AT1受體的親和性。培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，應(yīng)用鈣離子的熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載原代培養(yǎng)VSMC，應(yīng)用共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平的變化。將患者血清、提純AT1受體胞外自身抗體和血管緊張素Ⅱ(angiotoninⅡ，AngⅡ)分別作用于VSMC，觀察熒光強(qiáng)度變化來(lái)檢測(cè)VSMC胞漿游離鈣水平變化。并觀察AT1受體拮抗劑氯沙坦，α1腎

3、上腺素受體拮抗劑哌唑嗪，AT1受體胞外第二環(huán)肽抗原表位對(duì)AT1受體自身抗體的拮抗作用。 結(jié)果：ELISA檢測(cè)顯示22例難治性高血壓患者中有10例患者AT1受體細(xì)胞外第二環(huán)自身抗體陽(yáng)性，占45.5％，該抗體的檢出率明顯高于非難治高血壓組(n=24，12.5％，P＜0.05)。細(xì)胞免疫熒光染色顯示提純的AT1受體細(xì)胞外二環(huán)自身抗體能夠與VSMC膜表面AT1受體特異性結(jié)合。并且該抗體能夠刺激培養(yǎng)VSMC，使得胞內(nèi)游離鈣水平增高，呈現(xiàn)劑

4、量依賴效應(yīng)，說(shuō)明該抗體具有與AngⅡ類似激動(dòng)效應(yīng)。該自身抗體的激動(dòng)效應(yīng)能夠被AT1受體拮抗劑氯沙坦及AT1受體胞外第二環(huán)肽抗原表位所拮抗。 結(jié)論：AT1受體胞外第二環(huán)肽是自身免疫重要的抗原表位，針對(duì)該表位的抗體能夠與AT1受體特異結(jié)合并且模擬AngⅡ的激動(dòng)作用，促進(jìn)VSMC胞內(nèi)游離鈣水平升高，在難治性高血壓患者高血壓發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。應(yīng)用AT1受體拮抗劑氯沙坦能夠有效的阻斷該抗體的效應(yīng)。 第二部分 主動(dòng)免疫

5、AT1受體胞外肽段對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響 目的：觀察血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型(AT1)受體細(xì)胞外不同肽段主動(dòng)免疫自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)對(duì)血壓影響，探索針對(duì)AT1受體細(xì)胞外不同抗原表位的抗體對(duì)血壓的效應(yīng)，進(jìn)一步篩選具有降壓作用的肽段。 方法：選取大鼠AT1受體AT1A受體亞型，根據(jù)AT1A受體胞外肽段氨基酸序列設(shè)計(jì)肽段ATR11188、ATR12181、ATR13263、ATR13275，合成純化并與破傷風(fēng)類毒素載體蛋

6、白耦聯(lián)。SHR隨機(jī)分組：(1).對(duì)照組(n=7)，(2).ATR11188免疫組(n=7)，(3).ATR12181免疫組(n=8)，(4).ATR13263免疫組(n=6)，(5).ATR13275免疫組(n=6)。免疫各組均給于肽-破傷風(fēng)類毒素復(fù)合物加福氏佐劑皮下注射，主動(dòng)免疫7次。對(duì)照組給予相同時(shí)間點(diǎn)生理鹽水加福氏佐劑皮下注射。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)SHR的收縮壓、心率及血清抗體滴度。親和層析法提取各個(gè)抗肽抗體，刺激培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌

7、細(xì)胞(VSMC)，觀察抗體對(duì)VSMC細(xì)胞增殖的效應(yīng)，判斷各個(gè)抗體的對(duì)AT1受體效應(yīng)。 結(jié)果：各組肽段免疫大鼠后都能產(chǎn)生高滴度抗體。ATR12181組收縮壓(SBP)在第8周時(shí)，SBP為167.3±10.4mmHg較對(duì)照組180.6±8.0mmHg明顯下降，P＜0.05，該血壓水平可以維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。其他各免疫組血壓與對(duì)照組比較SBP水平無(wú)顯著差異。提取抗ATR12181抗體，免疫印跡結(jié)果與免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示該抗體能與VSMC細(xì)胞膜

8、上的AT1A受體特異性結(jié)合，并能夠拮抗AngⅡ?qū)SMC細(xì)胞的增殖作用。 結(jié)論：我們?cè)俅悟?yàn)證了針對(duì)ATR12181肽段抗體可以使SHR血壓下降，為降壓疫苗的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并且提示針對(duì)AT1受體細(xì)胞外不同抗原表位的抗體其生物效應(yīng)是不同的。 第三部分 ATR12181疫苗對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠靶器官的保護(hù)作用 目的：觀察具有降壓作用的ATR12181肽段主動(dòng)免疫自發(fā)性高血壓大鼠對(duì)心腎兩個(gè)重要的靶器官的保護(hù)作

9、用。 方法：根據(jù)大鼠AT1A胞外肽段氨基酸序列設(shè)計(jì)ATR12181，合成純化并與破傷風(fēng)類毒素耦聯(lián)加用福氏佐劑，制備ATR12181疫苗。分24周和64周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察ATR12181疫苗主動(dòng)免疫SHR后，對(duì)心腎器官的保護(hù)作用。SHR分組：(1).對(duì)照組24周(n=7)，(2).ATR12181免疫組24周(n=7)，(3).對(duì)照組64周，(4).ATR12181免疫組64周。免疫組均給于肽-破傷風(fēng)類毒素復(fù)合物加福氏佐劑皮下注射，

10、多次免疫后產(chǎn)生抗體后，鼠尾套管法測(cè)量各組大鼠血壓，觀察血壓隨時(shí)間變化。分別于24周及64周終止觀察，處死動(dòng)物，并測(cè)量大鼠體重、心臟重量，計(jì)算心臟體重比，留取動(dòng)物心臟和腎臟進(jìn)行Masson三色染色病理觀察和透射電鏡觀察，評(píng)價(jià)心腎病理變化情況。并且測(cè)定64周左心室及腎臟皮質(zhì)c-fos和c-jun的mRNA的水平。 結(jié)果：ATR12181肽段免疫大鼠后持續(xù)產(chǎn)生高滴度抗體。免疫組血壓于實(shí)驗(yàn)第8周較對(duì)照組明顯下降，并能持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。24

11、周時(shí)大體病理兩組動(dòng)物心腎沒(méi)有明顯變化，但免疫組心臟體重(3.70±0.13mg/g)比明顯低于對(duì)照組(3.37±0.14mg/g，P＜0.05)，Masson染色結(jié)果也提示，免疫組心臟的心肌間纖維化及血管周的纖維化均明顯輕于對(duì)照組，透射電鏡觀察對(duì)照組心室灶狀肌纖維排列紊亂并有線粒體堆積，而免疫組病變明顯減輕。64周大體病理觀察對(duì)照組SHR左心室肥厚，而免疫組肥厚不明顯，免疫組大鼠體重(538±36g)明顯重于對(duì)照組(383±18，P＜0

12、.01)，免疫組心臟重量(1.33±0.11g)明顯輕于對(duì)照組(1.59±0.06g，P＜0.01)，免疫組從心臟的超聲心動(dòng)圖上觀察各個(gè)室壁厚度指標(biāo)均明顯低于對(duì)照組。64周時(shí)免疫組Masson三染色顯示疫苗組腎臟腎小球及損傷不明顯，間質(zhì)纖維化也較對(duì)照組輕，對(duì)照組腎臟可見(jiàn)明顯的腎小球損傷、間質(zhì)纖維化和管型；透射電鏡下，對(duì)照組腎臟腎小球基底膜廣泛性增厚，間質(zhì)纖維化，免疫組腎臟超微病變明顯減輕，偶見(jiàn)局灶性基底膜增厚。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有病理指標(biāo)均顯

13、示ATR12181主動(dòng)免疫后，SHR血壓下降的同時(shí)心腎兩個(gè)靶器官保護(hù)作用明顯。進(jìn)一步的對(duì)AP-1信號(hào)的探索表明，ATR12181主動(dòng)免疫可以降低左心室及腎皮質(zhì)組織c-fos和c-jun的mRNA水平。 結(jié)論：ATR12181主動(dòng)免疫后降低SHR大鼠血壓的同時(shí)，通過(guò)降低AT1受體下游信號(hào)原癌基因c-fos和c-jun的表達(dá)減輕心肌重塑及腎臟的損傷。 第四部分 ATR12181疫苗安全性初步評(píng)價(jià) 目的：觀察A

14、TR12181疫苗多次免疫自發(fā)高血壓大鼠(SHR)，動(dòng)物主要器官是否發(fā)生自身免疫損傷。 方法：留取該研究第三部分中64周時(shí)間點(diǎn)ATR12181免疫組動(dòng)物及對(duì)照組動(dòng)物的重要器官，包括心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺、主動(dòng)脈和腸細(xì)膜動(dòng)脈，進(jìn)行HE病理染色，免疫組化染色觀察抗ATR12181抗體IgG在器官沉積狀況，并且對(duì)腎臟進(jìn)行電鏡觀察，評(píng)價(jià)器官病理變化。 結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，ATR12181免疫后，未在血管周及各個(gè)主要器官組

15、織中發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；免疫組化染色結(jié)果顯示，ATR12181免疫組大鼠靶器官的心肌、胸主動(dòng)脈及腎臟組織細(xì)胞膜上染色陽(yáng)性，表明大鼠免疫后，所形成的抗體可以結(jié)合于靶器官細(xì)胞膜上。腎臟透射電鏡發(fā)現(xiàn)ATR12181組SHR大鼠腎臟的腎小球基底膜發(fā)生局灶性的增厚，但對(duì)照組病變更明顯呈現(xiàn)廣泛的腎小球基底膜增厚。并且，ATR12181組的腎小球基底膜未見(jiàn)任何電子致密物沉積。 結(jié)論：對(duì)于ATR12181疫苗的初步安全性評(píng)價(jià)，ATR12181作為