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文檔簡(jiǎn)介
1、本實(shí)驗(yàn)著重觀察了AT<,1>-R AA對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位和相關(guān)離子電流,以及心肌變力性的影響。 研究材料和方法: 1、AT<,1>受體自身抗體的制備。 1.1 AT<,1>受體抗原肽段的合成:按照人AT<,1>受體細(xì)胞外第二環(huán)的功能表位肽段(165-191位,氨基酸序列為I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T-L)由西安美聯(lián)生物科技有限公司合成
2、。 1.2抗體制備:使用上述抗原肽段對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行為期8周的主動(dòng)免疫,制備抗AT<,1>受體抗血清,其效價(jià)用SA-ELISA方法檢測(cè)。然后利用MAb Trap Kit試劑盒對(duì)抗血清中的抗體IgG進(jìn)行提取和純化。純化后的抗體蛋白液混合后,先經(jīng)PAGE膠凝膠電泳檢測(cè)其純度,然后使用考馬斯亮蘭試劑盒對(duì)抗體進(jìn)行定量。 2、心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位和離子電流的測(cè)定。 2.1細(xì)胞分離:取健康Wistar大鼠,用Langen
3、dorff灌流裝置經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流酶解心臟為單個(gè)心肌細(xì)胞,選取橫紋清晰、膜良好的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2.2全細(xì)胞膜片鉗記錄方法:細(xì)胞復(fù)鈣,于倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞充分貼壁后用臺(tái)氏液灌流。兩步拉制玻璃電極,充灌電極內(nèi)液,與細(xì)胞封接后破膜,記錄心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位和L-型鈣離子通道電流(I<,Ca-L>)。 2.3分組:(1)正常對(duì)照組(control,n=6),正常臺(tái)氏液灌流;(2)陰性IgG組(negativeIgG,n=
4、6),給予陰性IgG;(3)AT<,1>受體自身抗體組(AT<,1>-R AA,n=6),給予AT<,1>受體自身抗體IgG;(4)AT<,1>受體自身抗體加AT<,1>受體阻斷劑組(AT<,1>-R AA+losartan,n=6),同時(shí)給予AT<,1>受體自身抗體和AT<,1>受體阻斷劑losartan:(5)血管緊張素-Ⅱ組(Ang-H,n=6),給予100 nmol/L,的Ang-Ⅱ;(6)血管緊張素-Ⅱ加AT<,1>受體阻斷劑
5、組(Ang-Ⅱ+losartan,n=6),同時(shí)給予Ang-Ⅱ和losartan。AT<,1>-R AAIgG均分別按照10nmol/L、20nmol/L和50nmol/L三個(gè)濃度進(jìn)行處理,觀察大鼠心室肌細(xì)胞L型Ca<'++>通道電流(I<,Ca-L>)電流密度的變化和動(dòng)作電位時(shí)程的變化,并與100 nmol/L的Ang-Ⅱ的作用進(jìn)行比較。另外還同時(shí)觀察了AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan對(duì)抗體IgG的作用的影響。 3
6、、在體大鼠心功能的測(cè)定。健康雄性成年Wistar大鼠,體重250-280g,隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(生理鹽水),AT<,1>受體自身抗體組(生理鹽水+AT<,1>受體自身抗體),AT<,1>受體自身抗體加AT<,1>受體阻斷劑組(生理鹽水+AT<,1>受體自身抗體+losartan),血管緊張素-Ⅱ組(生理鹽水+losartan)和血管緊張素-Ⅱ加AT<,1>受體阻斷劑組(生理鹽水+Ang-Ⅱ+losartan),每組5只。稱重后經(jīng)腹
7、腔注射氨基甲酸乙酯(20%,1g/kg)麻醉,經(jīng)右頸總動(dòng)脈行左心室插管,經(jīng)股靜脈注射藥物給予不同處理,由ms2000生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄左心室壓力和左心室壓力變化率等心功能指標(biāo)。 研究結(jié)果: 1、利用AT<,1>受體細(xì)胞外第二環(huán)表位功能肽段主動(dòng)免疫大鼠的結(jié)果: 免疫大鼠血清中AT<,1>受體自身抗體滴度的變化從免疫后的第二周開(kāi)始升高(圖1:表1)。第二次加強(qiáng)免疫后的第二周(總第八周),大鼠血清中的抗體滴度,從
8、免疫前的1:25.56±9.22升高到1:1490.00±847.58(P<0.01)。對(duì)照組的血清抗體未見(jiàn)明顯變化。 2、AT<,1>受體自身抗體蛋白定性及定量測(cè)定結(jié)果: PAGE膠凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,純化后的抗體在電泳時(shí),僅有一條條帶出現(xiàn),分子量為160KDa左右,與IgG標(biāo)準(zhǔn)品相一致,表明純化結(jié)果理想。同時(shí),經(jīng)考馬斯亮蘭試劑盒測(cè)定蛋白濃度為2.38mg/mL。 3、AT<,1>受體自身抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞
9、動(dòng)作電位時(shí)程(APD<,50>和APD<,90>)的影響: 給予AT<,1>受體自身抗體后的作用結(jié)果顯示,該抗體可以使大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的50%復(fù)極化時(shí)間(APD<,50>)和90%復(fù)極化時(shí)間(APD<,90>)均呈劑量依賴性縮短(圖3,圖5,表2,圖5)。經(jīng)過(guò)正常臺(tái)氏液的灌流,APD<,50>和APD<,90>可以大部分恢復(fù),證明該縮短變化是由AT<,1>受體自身抗體作用產(chǎn)生的(圖2)。 為驗(yàn)證抗體對(duì)AT<,1>受
10、體的效應(yīng),對(duì)比觀察了AT<,1>受體激動(dòng)劑Ang-Ⅱ的作用。結(jié)果顯示,Ang-Ⅱ的作用與AT<,1>受體自身抗體的作用是一致的,它也可使動(dòng)作電位時(shí)程(APD<,50>和APD<,90>)明顯縮短(圖4,表3)。 AT<,1>受體自身抗體與受體激動(dòng)劑Ang-Ⅱ的作用均可被,AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan所阻斷。如圖(3,4)所示,給予100nmol/L的Losartan后,可以幾乎完全拮抗上述Ang-Ⅱ和AT<,1>
11、受體自身抗體對(duì)于動(dòng)作電位APD<,50>和APD<,90>縮短的作用,證明該抗體是通過(guò)AT<,1>受體而產(chǎn)生作用的。 4、AT<,1>受體自身抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞I<,Ca-L>的影響結(jié)果顯示,10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L濃度的抗AT<,1>受體自身抗體可以明顯增加I<,Ca-L>電流,并呈劑量依賴性效應(yīng)(圖7,圖9,表4)。例如50nmol/L的AT<,1>受體自身抗體可以使I<,Ca-L>電流由給藥前
12、4.11±0.58(pA/pF)增加到8.55±0.13(pA/pF)(P<0.01)。經(jīng)過(guò)正常臺(tái)氏液的灌流,該增加部分可以大部分恢復(fù),證明該增加作用是由AT<,1>受體自身抗體作用產(chǎn)生的,而非膜電流不穩(wěn)定所致(圖6)。 100nmol/L的Ang-Ⅱ作用的結(jié)果顯示,AT<,1>受體激動(dòng)劑Ang-Ⅱ的作用與AT<,1>受體自身抗體的作用是一致的,它也可以顯著增加I<,Ca-L>電流(圖8,表5)。 給予100nmol/L
13、的AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan后,可以幾乎完全拮抗上述Ang-Ⅱ和AT<,1>受體自身抗體對(duì)于該電流的增強(qiáng)作用,證明該抗體也是通過(guò)AT<,1>受體而產(chǎn)生作用的(圖7,8)。 5、AT<,1>受體自身抗體對(duì)于抑制鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)后的大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響本實(shí)驗(yàn)室以前的研究證實(shí).AT<,1>受體抗體除可增強(qiáng)I<,Ca-L>電流外,還可增強(qiáng)鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)。為分析AT<,1
14、>受體抗體縮短心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的機(jī)理,我們還觀察了用鋰離子取代鈉離子進(jìn)行灌流,抑制鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)的情況下,AT<,1>-R AA對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程的影響。結(jié)果表明,在抑制鈉一鈣交換電流(I<,Na/Ca>)后,可見(jiàn)動(dòng)作電位時(shí)程縮短(圖10),在此基礎(chǔ)上給予AT<,1>受體自身抗體,則未再引起大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位APD<,50>和APD<,90>的改變(圖11,表6)。在此條件下給予Ang-Ⅱ,其結(jié)果也與AT<,1>
15、受體自身抗體的作用一致,未再引起大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位APD<,50>和APD<,90>的改變(圖12,表7)。 6、AT<,1>受體自身抗體對(duì)大鼠心功能的影響AT<,1>受體自身抗體可顯著升高大鼠LVSP、dp/dtmax和-dp/dtmax。Ang-Ⅱ的作用與AT<,1>受體激動(dòng)劑Ang-Ⅱ的作用一致(圖13,圖14,圖15)。給予AT<,1>受體選擇性拮抗劑losartan后,可以大部分消除上述Ang-Ⅱ和AT<,1>受體自身抗體對(duì)
16、于心功能的改變,證明該抗體通過(guò)AT<,1>受體發(fā)揮作用。 研究結(jié)論: 1.按照人血管緊張素Ⅱ受體-Ⅰ亞型(AT<,1>受體)細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(165~191位)的氨基酸序列合成的肽段作為抗原,主動(dòng)免疫Wistar大鼠,成功獲得了高滴度的AT<,1>受體自身抗體(AT<,1>-R AA),并利用高特異性的親和柱提取后,得到較為理想的足量的純化IgG,借以進(jìn)行抗體對(duì)心臟活動(dòng)的生物學(xué)效應(yīng)研究。 2.AT<,1>
17、-R AA能顯著縮短心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD<,50>和APD<,90>),其作用與AT<,1>受體激動(dòng)劑Ang-Ⅱ的效應(yīng)是一致的,提示該抗體對(duì)AT<,1>受體有激動(dòng)劑樣效應(yīng)。此效應(yīng)可被AT<,1>受體特異性阻斷劑所阻斷,說(shuō)明該抗體作用是通過(guò)AT<,1>受體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。AT<,1>-R AA縮短動(dòng)作電位時(shí)程的機(jī)制,可能與其促進(jìn)鈣離子內(nèi)流(增強(qiáng)心室肌細(xì)胞I<,Ca-L>),繼而促進(jìn)鉀離子外流有關(guān)。 3.AT<,1>-R AA能
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