actA缺失型李斯特細(xì)菌載體HIV疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、T細(xì)胞免疫反應(yīng)在控制HIV感染中具有重要作用，單核細(xì)胞增多性李斯特細(xì)菌(Listeria monocytogenes，Lm)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，近年來頗受關(guān)注。由于李斯特菌對(duì)人和動(dòng)物具有致病性，需要對(duì)菌體本身進(jìn)行改造保證其安全性之后才能作為遞呈目的蛋白的疫苗載體使用。本研究以Lm actA為靶基因，以HIV-1 gag為外源基因，應(yīng)用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)gag并缺失actA的重組減毒Lm，并對(duì)其生物學(xué)特征和免疫學(xué)特性進(jìn)行初

2、步探討和比較研究。
　　 1.actA缺失型李斯特細(xì)菌載體HIV疫苗的構(gòu)建采用PCR方法從Lm10403s基因組中擴(kuò)增出actA基因的啟動(dòng)子區(qū)域(P)和終止子區(qū)域(T)，分兩步插入至穿梭載體pKSV7中，從質(zhì)粒pVI75gagpolenv中采用PCR方法擴(kuò)增gag基因，將gag基因插入至pKSV7-P-T。經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，分別電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)Lm野生型、Lm△sepA、Lmdd△sepA中，經(jīng)過氯霉素和高溫雙重選擇壓力實(shí)現(xiàn)同源重

3、組，得到重組菌Lm△actA-gag、Lm△sepA/△actA-gag、Lmdd△sepA/△actA-gag。應(yīng)用2對(duì)引物對(duì)重組菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示外源基因gage定點(diǎn)整合于載體菌基因組中。Western blot結(jié)果表明HIV-1 gag基因已經(jīng)在Lm中得到正確表達(dá)和分泌。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)表明重組李斯特細(xì)菌能感染并在J774A.1細(xì)胞中增殖對(duì)3株攜帶gag基因的重組細(xì)菌Lm△actA-gag、Lm△sepA/△a

4、ctA-gag、Lmdd△sepA/AactA-gag以及本科室構(gòu)建的LmddBsdalHIVgag進(jìn)行了體外感染J774A.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明這些菌株都能感染小鼠巨噬細(xì)胞并表達(dá)Gag蛋白，其中，Lm△actA-gag在細(xì)胞內(nèi)增殖最快，Gag蛋白表達(dá)量達(dá)500 pg/7×105細(xì)胞；Lmdd△sepA/△actA-gag因無(wú)D-Ala在細(xì)胞中幾乎不增殖，Gag蛋白表達(dá)量也最低；Lm△sepA/△actA-gag和LmddBsdalHI

5、Vgag增殖速率相似，Gag蛋白表達(dá)量分別為300 pg/7×105細(xì)胞、450 pg/7×105細(xì)胞。
　　 3.actA缺失型李斯特細(xì)菌載體HIV疫苗對(duì)BALB/c小鼠的毒力較野生型有大幅度下降野生型對(duì)BALB/c小鼠的致死率在103CFU-104CFU之間，四株重組菌相比野生型Lm毒力均有大幅下降。當(dāng)接種劑量為1×108CFU時(shí)，接種Lm△actA-gag和LmddBsdalHIVgag的小鼠均死亡，接種Lm△sepA/△

6、actA-gag和Lmdd△sepA/△actA-gag的小鼠全部存活。低于1×108CFU劑量時(shí)，四種菌株感染的小鼠全部存活，但表現(xiàn)出一定的病理特征，當(dāng)劑量為5×107CFU時(shí)，Lm△actA-gag的毒力最大，免疫后小鼠體重下降約20％；Lmdd△sepA/△actA-gag為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，其毒力最?。幻庖週mddBsdalHIVgag、Lm△sepA/△actA-gag后小鼠體重分別下降15％和5％。
　　 4.actA

7、缺失型李斯特細(xì)菌載體HIV疫苗單獨(dú)或與痘苗病毒載體HIV疫苗(rTV)聯(lián)合免疫后小鼠后產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞免疫反應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，本文構(gòu)建的重組Lm疫苗單獨(dú)免疫小鼠就可以產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中Lm△actA-gag最強(qiáng)，誘導(dǎo)分泌特異性IFN-γ的細(xì)胞數(shù)為930±41sfu/106細(xì)胞；Lmdd△sepA/△actA-gag最弱，27±25 sfu/106細(xì)胞；Lm△sepA/△actA-gag和LmddBsdalHIVgag分別為808±229

8、 sfu/106細(xì)胞和767±238 sfu/106細(xì)胞；采用痘苗病毒載體HIV疫苗(rTv)初次免疫，Lm重組疫苗加強(qiáng)的聯(lián)合免疫策略可以激發(fā)超強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中，1×rTV+2×Lm△actA-gag免疫組合所誘導(dǎo)的特異性IFN-γ和TNF-αCD8+T細(xì)胞百分值高達(dá)1.3％，其余則在0.2％到1.0％之間。此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)重組Lm疫苗免疫小鼠一次，兩次或三次所誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)無(wú)顯著差異。
　　 綜上所述，本文構(gòu)建