新型免疫刺激分子增強(qiáng)DNA疫苗免疫原性的研究.pdf

1、hsp65作為DNA疫苗的模式抗原是機(jī)體對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌入侵的重要免疫保護(hù)性及治療抗原。然而,增強(qiáng)DNA疫苗免疫效果則是令人期待的。因此我們構(gòu)建麻風(fēng)分枝桿菌熱休克蛋白65(Heat shock protein65,Hsp65)的原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)、純化該重組蛋白并制備Anti-Hsp65小鼠多克隆抗體；并探討在麻風(fēng)分枝桿菌熱休克蛋白Hsp65終止密碼與真核表達(dá)載體:polyA之間插入CpG基序以提高DNA疫苗在小鼠中誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和

2、體液免疫；同時(shí)探討以內(nèi)含子A增強(qiáng)Hsp65在真核細(xì)胞中的表達(dá)效率及提高DNA疫苗在小鼠中誘導(dǎo)的免疫原性。通過ELISA、ELISPOT和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析,結(jié)果小結(jié)如下:
　　 1、PCR擴(kuò)增所獲得hsp65基因序列與GenBank公布的完全一致,表達(dá)的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約65 kDa,ELISA測(cè)定表明Anti—Hsp65多克隆抗體效價(jià)約為1:12,800,Western-blotting分析表明該多克隆

3、抗體具有良好的反應(yīng)特異性；
　　 2、含有CpGO2的重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,其IFN-α,IL-12,IL-17A和IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯增加,但I(xiàn)L-4和CD86的mRNA相對(duì)表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生.Anti—Hsp65特異性總IgG和IgG2a抗體水平也更高,分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞頻率也增加；
　　 3、含有內(nèi)含子A的重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV4.0hsp6

4、5較之不含內(nèi)含子A的pVAX1hsp65在人胚腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞中的抗原表達(dá)量更高,免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的Anti-Hsp65特異性總IgG和IgG2a抗體水平也更高,分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞頻率增加。
　　 經(jīng)過上述驗(yàn)證,我們成功表達(dá)與純化了麻風(fēng)分枝桿菌Hsp65的重組蛋白,并制備了效價(jià)及特異性良好的Anti-Hsp65小鼠多克隆抗體；在抗原轉(zhuǎn)錄區(qū)下游插入CpG免疫刺激基序能更好地提高DNA疫苗在小鼠中