鼠疫二價顆粒疫苗和重組李斯特菌載體疫苗的研究.pdf

1、鼠疫耶爾森菌被普遍認為是可能用于生物戰(zhàn)劑或生物恐怖的高致病微生物，同時，也存在肺炎型鼠疫在人類傳播導致致死性肺炎的可能性。用于人群使用的鼠疫疫苗有兩種，一種是用毒性鼠疫桿菌經(jīng)甲醛處理而成的死菌疫苗，另一種是用減毒突變株EV76制成的減毒活菌疫苗。但死菌疫苗成本高，內(nèi)毒素成分不確定，要求多次加強免疫，而且有不同程度的副作用，已經(jīng)停止了使用。EV76是耶爾森鼠疫桿菌的無色素突變株，其毒性雖然大大減弱，保護效果比死菌苗好，但它仍有使實驗鼠致病

2、的毒性，EV76在人群使用，不同菌株的保護效果及副作用各不相同而受到質(zhì)疑，因而開發(fā)新的鼠疫疫苗很有必要。最近已有不少鼠疫疫苗的研究報道，包括亞單位疫苗，DNA疫苗和重組減毒沙門氏菌載體疫苗。盡管以上列舉的鼠疫疫苗策略都成功的被報道，但它們?nèi)杂性S多不足之處，包括副作用，對吸入性鼠疫缺乏保護，需要頻繁的加強免疫等。 本研究旨在研究一種全新的鼠疫疫苗，該疫苗要安全，廉價，并能刺激機體產(chǎn)生抗原特異性免疫保護反應，包括體液免疫反應、細胞免

3、疫反應和粘膜免疫反應。另外，該疫苗要易于接種，以預防使用鼠疫桿菌發(fā)動生物恐怖襲擊時，可以快速，大規(guī)模地自我接種。 通過在小鼠身上的實驗研究發(fā)現(xiàn)，鼠疫耶爾森菌的F1蛋白和V抗原蛋白是其重要的保護性抗原。本研究共分三部分，從鼠疫桿菌的F1和V抗原基因著手，應用GEM顆粒疫苗系統(tǒng)和減毒李斯特菌載體疫苗系統(tǒng)用于開發(fā)理想的鼠疫疫苗。 第一部分：我們通過一種不含重組DNA，無繁殖能力的革蘭陽性細菌菌體作為顆粒疫苗的核心(GEM)，通

4、過錨蛋白與重組表達的鼠疫耶爾森菌F1蛋白和V抗原蛋白結(jié)合制成鼠疫二價顆粒疫苗，滴鼻接種免疫Balb/c小鼠(疫苗免疫小鼠劑量定為：2.5x109 GEM/20μg protein/dose)，檢測該疫苗誘導機體產(chǎn)生高滴度抗原特異性抗體反應和抗原特異性T淋巴細胞分泌IFN—γ的能力。實驗證明該二價鼠疫顆粒疫苗安全無毒，無副作用，滴鼻接種能產(chǎn)生高滴度的抗原特異性抗體，包括粘膜保護性抗體，但抗原特異性細胞免疫反應較弱，為彌補該顆粒疫苗這一弱點

5、，本研究通過在二價疫苗顆粒上同時結(jié)合上鼠疫桿菌的鞭毛素蛋白(革蘭陰性菌的鞭毛素蛋白是TLR5的配體)，上調(diào)了該疫苗刺激機體產(chǎn)生抗原特異性細胞免疫反應的水平。 第二部分：利用減毒李斯特菌作為疫苗載體，能刺激機體產(chǎn)生較強的抗原特異性細胞免疫反應的特點，我們構(gòu)建了分泌表達鼠疫F1和V抗原的鼠疫重組李斯特菌載體疫苗，滴鼻免疫接種Balb/c小鼠，檢測該疫苗誘導機體產(chǎn)生抗原特異性抗體反應和細胞免疫反應的水平。本章重點介紹了PrfA突變李斯

6、特菌株作為疫苗載體可以提高外源基因的表達水平，并提高了疫苗誘導產(chǎn)生的抗原特異性免疫反應。 第三部分：聯(lián)合接種二價GEM顆粒疫苗和減毒李斯特菌載體疫苗兩種鼠疫疫苗，通過同源性和異源性免疫接種策略(再次免疫時采用與初次免疫不同策略的疫苗)，研究其可否誘導機體同時產(chǎn)生強的細胞免疫反應和體液免疫反應，包括保護性粘膜免疫反應，使兩種疫苗的優(yōu)勢互補。實驗證明，初次免疫接種鼠疫減毒李斯特菌載體疫苗，加強免疫接種二價GEM顆粒鼠疫疫苗，可同時誘

7、導出更強的抗F1、V抗原的細胞免疫和體液免疫反應包括粘膜保護性免疫反應。 本研究最重要的研究結(jié)果可概括為以下五點： (1)用GEM顆粒制作的鼠疫二價顆粒疫苗通過滴鼻接種，能誘導出高滴度的特異性體液免疫反應，包括粘膜保護性免疫反應。 (2)鞭毛素蛋白可以上調(diào)GEM二價鼠疫顆粒疫苗誘導產(chǎn)生的特異性細胞免疫反應。 (3)以減毒李斯特菌作為疫苗載體，鼠疫重組李斯特菌載體疫苗滴鼻接種，在脾臟和外周血單個核細胞中能誘

8、導出很強的抗原特異性T淋巴細胞分泌IFN—γ反應。 (4) prfA基因突變減毒李斯特菌株(Listeria△actA prfA*G155S)，可提高外源目的基因的表達水平，也可增強疫苗誘導的特異性細胞免疫和體液免疫反應。 (5)異源性免疫接種，即初次免疫接種減毒李斯特菌載體鼠疫疫苗，而加強免疫接種二價GEM顆粒鼠疫疫苗，可同時誘導出很強的抗F1、V抗原的細胞免疫和體液免疫反應包括粘膜保護性免疫反應。 本研究通過