晚期氧化蛋白產(chǎn)物導(dǎo)致THP-1巨噬細胞的氧化應(yīng)激損傷及藥物的干預(yù)作用.pdf

1、1.研究背景:
　　 AOPP是Witko-Sarsat等于1996年首次在慢性腎衰竭(CRF)病人血漿中發(fā)現(xiàn)的與尿毒癥有關(guān)的毒素分子，是中性粒細胞髓過氧化物酶(MPO)催化活性氧生成的次氯酸(HClO)作用于蛋白質(zhì)而形成含有雙酪氨酸的蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)產(chǎn)物。血漿AOPP水平與雙酪氨酸、戊糖素、新喋呤等氧化應(yīng)激標志物呈正相關(guān)，與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化劑呈負相關(guān)，因此AOPP被認為是反映慢性腎衰竭時氧化應(yīng)激的標志物

2、。其作為氧化應(yīng)激新的標志物并間接反映著體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)水平，是有一定生物學(xué)活性的促炎癥反應(yīng)介質(zhì)和尿毒癥毒素分子，參與慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)和透析患者臨床一些并發(fā)癥發(fā)生的病理生理過程。AOPP在體內(nèi)外均可激發(fā)單核細胞的呼吸爆發(fā)，刺激單核細胞合成、釋放大量促炎性細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等，促發(fā)細胞炎癥效應(yīng)，并同時激發(fā)中性粒細胞的呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致更強的氧化應(yīng)激，正反饋增加自身的形成并

3、增強對單核細胞的效應(yīng)，進而造成全身微炎癥狀態(tài)。已經(jīng)證實，AOPP是一種促炎癥和促氧化應(yīng)激介質(zhì)，單核/巨噬細胞作為體內(nèi)炎癥細胞因子和氧化劑的主要來源是它選擇性作用的靶細胞。
　　 尿毒清顆粒是南方醫(yī)院研制的抗腎衰產(chǎn)品，能有效減輕CRF病人的臨床癥狀，改善腎功能，延緩腎功能減退。復(fù)方黃甘顆粒是尿毒清顆粒的第二代產(chǎn)品，本實驗室前期的動物體內(nèi)實驗表明，復(fù)方黃甘提取物能顯著性地降低CRF大鼠循環(huán)中氧化物質(zhì)AOPP的含量，減輕CRF大鼠的氧

4、化應(yīng)激反應(yīng)，但其具體的作用機制尚需進一步探討。
　　 丹皮酚(Paeonol，Pae)又稱牡丹酚，是中藥材毛莨科植物牡丹(PaeoniaSuffruicosa Andr)根皮和蘿摩科植物徐長卿[Pycnostelma Paniculatum(Bunge)K.Schum]干燥根或全草的主要有效成分。大量研究表明，丹皮酚具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等作用，對脾臟、胸腺等免疫器官及淋巴細胞、單核細胞等免疫分子均具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用

5、，同時具有抗氧化、抗菌抗腫瘤、保護心血管、鎮(zhèn)靜催眠及解熱鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用。但其是否會影響巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)還不太清楚。
　　 本次實驗旨在通過體外人工合成AOPP，刺激THP-1巨噬細胞后，用于研究復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對其氧化應(yīng)激損傷的影響及其可能的機制。
　　 2.研究方法:
　　 2.1無內(nèi)毒素AOPP修飾蛋白的制備與鑒定
　　 將無內(nèi)毒素的牛血清白蛋白(BSA)與次氯酸鈉(NaClO)以1/7

6、0、1/140、1/280的摩爾比例混合均勻，室溫反應(yīng)30 min，制備出三種不同修飾程度的AOPP。按照Witko-Sarsat等的紫外分光光度計法，于酸性條件下，340 nm測定AOPP對氯胺-T的相對濃度(μM); Bradford法于595 nm處測定AOPP制品和對照BSA樣品中總蛋白的含量(mg/ml);凝膠法鱟試劑(靈敏度0.25EU/ml)定性檢測AOPP制品中內(nèi)毒素的含量。
　　 2.2復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對

7、AOPP誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞氧化應(yīng)激損傷的影響
　　 2.2.1 THP-1巨噬細胞的誘導(dǎo)分化
　　 以160 nM的不含血清的PMA溶液刺激人THP-1單核細胞株24 h后使之轉(zhuǎn)化成THP-1巨噬細胞。
　　 2.2.2復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對THP-1巨噬細胞活力的影響
　　 用MTT還原法測定細胞活性。不同修飾程度不同濃度的AOPP與細胞共同培養(yǎng)24 h后，于多功能酶標儀570 nm處測定細胞活力

8、。AOPP預(yù)處理巨噬細胞24 h，棄去培養(yǎng)上清，再用復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定細胞活力。
　　 2.2.3復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞NO產(chǎn)生的影響
　　 不同修飾程度不同濃度的AOPP與THP-1巨噬細胞共同孵育24 h，收集上清，用Griess試劑法測定培養(yǎng)上清亞硝酸鹽的含量，間接反映NO的產(chǎn)生量。AOPP與巨噬細胞共同培養(yǎng)24 h，復(fù)方黃甘提取物和丹皮酚分別干預(yù)處理24

9、 h，用Griess試劑法測定培養(yǎng)上清NO濃度。熒光定量PCR測定iNOS的基因表達。
　　 2.2.4復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞ROS、炎性因子產(chǎn)生的影響
　　 不同修飾程度不同濃度的AOPP與THP-1巨噬細胞共同孵育24 h，培養(yǎng)結(jié)束后用對ROS敏感的熒光探針DCFH-DA標記細胞，用多功能酶標儀在λex=485nm、λem=535 nm下測定細胞經(jīng)不同刺激后細胞內(nèi)氧化DCFH產(chǎn)生的熒

10、光量，即細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量。復(fù)方黃甘提取物和丹皮酚分別預(yù)處理0.5 h、1h和2h，AOPP與巨噬細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h;在阻斷實驗中，細胞分別與自由基清除劑NAC，NADPH抑制劑apocynin、DPI，NF-κB抑制劑PDTC等37℃避光孵育0.5 h、1h和2h后再用AOPP刺激24 h，培養(yǎng)結(jié)束后測定細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量。培養(yǎng)上清用ELISA法測定TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白分泌量;熒光定量PCR測定TNF-α、IL

11、-1β、IL-6和MCP-1的基因表達水平。
　　 2.2.5抑制劑PDTC對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞的iNOS表達的影響
　　 用AOPP預(yù)處理巨噬細胞24 h，然后棄去培養(yǎng)上清，再用含PDTC(10μM)的RPMI1640培養(yǎng)基與細胞共同培養(yǎng)24 h，熒光定量PCR測定iNOS mRNA的表達。
　　 2.2.6丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞RAGE受體及清道夫受體CD36、SR-A、SR-

12、B1的影響
　　 用AOPP預(yù)處理巨噬細胞24 h，然后棄去培養(yǎng)上清，再用含丹皮酚的RPMI1640培養(yǎng)基與細胞共同培養(yǎng)24 h，熒光定量PCR測定RAGE、CD36、SR-A和SR-B1受體的表達情況。
　　 3.研究結(jié)果:
　　 3.1 AOPP的鑒定
　　 按照Witko-Sarsat法制備的1/70，1/140，1/280三種修飾程度的AOPP濃度分別為168.5μM、1047.8μM、2340.

13、6μM，遠遠高于未修飾的BSA的0.58μM。且所有AOPP制備品經(jīng)凝膠法鱟試劑法測定內(nèi)毒素含量均低于0.25 EU/ml。
　　 3.2復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞氧化應(yīng)激損傷的影響
　　 3.2.1復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對THP-1巨噬細胞活力的影響
　　 不同修飾程度不同濃度的AOPP和兩種藥物與細胞分別培養(yǎng)24 h，MTT法測定細胞活力，結(jié)果顯示，與對照組相比，其對細胞活力無顯著

14、性影響。
　　 3.2.2 AOPP修飾對THP-1巨噬細胞NO產(chǎn)生的影響
　　 未經(jīng)HClO氧化修飾的BSA誘導(dǎo)產(chǎn)生NO的量與空白組相比顯著性升高。低濃度HClO氧化修飾產(chǎn)生的AOPP(1/70)也能顯著性升高THP-1巨噬細胞產(chǎn)生NO的量，高濃度HClO氧化修飾產(chǎn)生的AOPP（1/140和1/280）則完全喪失了誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞產(chǎn)生NO的能力。但AOPP(1/140)的濃度達到200μg/ml時，能顯著性地抑制

15、THP-1巨噬細胞NO的產(chǎn)生，抑制程度隨AOPP濃度的增加而升高。
　　 3.2.3復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞NO產(chǎn)生的影響
　　 復(fù)方黃甘提取物濃度在100-400μg/ml范圍內(nèi)，顯著性逆轉(zhuǎn)AOPP對THP-1巨噬細胞NO產(chǎn)生的影響，且產(chǎn)生NO的量隨復(fù)方黃甘提取物濃度的增加而增加。丹皮酚濃度在100-400μM范圍內(nèi)，也能顯著性增加AOPP對THP-1巨噬細胞NO產(chǎn)生的影響，時間效應(yīng)顯示

16、，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO的量隨培養(yǎng)時間的延長而增加。
　　 3.2.4 AOPP修飾對THP-1巨噬細胞ROS產(chǎn)生的影響
　　 未經(jīng)HClO氧化修飾的BSA不能誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞產(chǎn)生ROS。AOPP氧化修飾越高，產(chǎn)生的ROS的量也越多，當AOPP氧化修飾程度達1/140，能顯著性增加ROS的量，1/280 AOPP進一步刺激ROS的產(chǎn)生。AOPP(1/140)的濃度達到200μg/ml時，其誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS的量最高。用抑制劑

17、apocynin、DPI、NAC和PDTC預(yù)孵育細胞0.5 h、1h和2h，再用AOPP繼續(xù)培養(yǎng)24 h，結(jié)果表明四種抑制劑均能顯著性抑制ROS的產(chǎn)生，且隨著濃度及預(yù)孵育時間的延長呈現(xiàn)一定的依賴性，其中PDTC的抑制作用最為顯著。
　　 3.2.5復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞ROS產(chǎn)生的影響
　　 隨著預(yù)孵育時間的延長，復(fù)方黃甘提取物對AOPP誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞ROS產(chǎn)生的抑制作用也提高。

18、當復(fù)方黃甘提取物預(yù)孵育時間為1h，濃度為400μg/ml時，其對AOPP誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞ROS產(chǎn)生的抑制作用最大，抑制率為25.76％，弱于抑制劑PDTC的抑制作用，但高于其他三種抑制劑的抑制程度。
　　 三個時間點的丹皮酚均能顯著性抑制AOPP誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞ROS的產(chǎn)生量，且隨著丹皮酚濃度的增加其對THP-1巨噬細胞ROS的產(chǎn)生量的抑制作用顯著性升高。當?shù)てし宇A(yù)孵育時間為1h，濃度為400μM時，其對AOPP誘導(dǎo)

19、THP-1巨噬細胞ROS產(chǎn)生的抑制作用最大，抑制率為19.57％，略高于抑制劑apocynin、DPI和NAC的抑制作用，但仍低于抑制劑PDTC的抑制程度。
　　 3.2.6復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞細胞因子產(chǎn)生的影響
　　 AOPP能顯著性上調(diào)THP-1巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達及蛋白分泌。用四種抑制劑預(yù)處理0.5 h后再給以AOPP刺激，結(jié)果顯示它們均能顯著性抑制

20、AOPP誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達及蛋白分泌。當用復(fù)方黃甘提取物及丹皮酚預(yù)處理后，均能顯著性下調(diào)AOPP誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達及蛋白分泌，但其下調(diào)程度弱于DPI和PDTC。
　　 3.2.7丹皮酚對AOPP誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞MCP-1、RAGE受體及清道夫受體CD36、SR-A、SR-B1的影響
　　 AOPP能顯著性上調(diào)RAGE的表達

21、，丹皮酚濃度在100-200μM范圍內(nèi)，能顯著性抑制AOPP誘導(dǎo)的RAGE的表達上調(diào)。 AOPP能顯著性上調(diào)CD36的表達，丹皮酚濃度在100-400μM范圍內(nèi)，均能顯著性抑制AOPP誘導(dǎo)的CD36的表達上調(diào)，且隨著濃度的增加，其抑制作用逐漸減弱。AOPP能顯著性下調(diào)SR-A的表達，丹皮酚濃度到達200μM時，能顯著性上調(diào)AOPP誘導(dǎo)的SR-A的表達，且隨著濃度的增加，其SR-A的表達量逐漸增加。AOPP能顯著性下調(diào)SR-B1的表達，丹

22、皮酚濃度在100-400μM范圍內(nèi)，均能顯著性上調(diào)AOPP誘導(dǎo)的SR-B1的表達，且隨著濃度的增加，其SR-B1的表達量逐漸增加。
　　 4.研究結(jié)論:
　　 4.1復(fù)方黃甘提取物可能通過升高NO和降低ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1，減輕微炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，從而達到延緩腎衰進展的治療作用。
　　 4.2丹皮酚可能通過調(diào)節(jié)THP-1巨噬細胞表面RAGE、CD36、SR-A和SR-B1受體