芍藥苷對晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指機體在遭受各種有害刺激時，組織或細胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破，各類自由基，如活性氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)以及活性氮自由基(Reativenitrogen species，RNS)無法及時被清除，而在機體內(nèi)或細胞內(nèi)蓄積引起一系列病理生理反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織損傷的過程。
　　芍藥苷(paeoniflorin)是中

2、藥赤芍的主要有效成分之一，是一種單萜類糖苷化合物。國內(nèi)外學者對芍藥苷展開了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種生物學效應(yīng)，并且毒副作用較小。已有報道，芍藥苷能夠抗自由基損傷，抑制細胞內(nèi)鈣超載活性。而在細胞學與動物實驗方面，芍藥苷能夠通過提高谷胱甘肽(GSH)水平抑制6-OH多巴胺誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡，其原因可能主要源于其抗氧化能力;此外，芍藥苷在不影響Akt，JNK，p38和ERK1/2磷酸化的情況下，可以顯著減

3、弱6-OH多巴胺誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞核因子κB(NF-κB)易位。
　　然而，芍藥苷是否能夠消除AOPPs對血管內(nèi)皮細胞的線粒體的破壞作用，抑制ROS的生成，以降低其氧化損傷？是否通過干預(yù)AOPPs刺激下RAGE-NADPH(Nox2/Nox4)—ROS—NF-κB—HIF-1α/VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以實現(xiàn)其針對AS病程的干預(yù)？這些假設(shè)需要我們進一步試驗證明。
　　研究方法：
　　2.1 無內(nèi)毒素AOPPs

4、的制備與鑒定
　　按照David R改良的Witko-sarsat法制備晚期過氧化物修飾蛋白儲存液。按照Witko-Sarsat等的紫外分光光度法測定AOPPs對氯胺-T的相對濃度(μM);BCA法測定AOPPs和未修飾的BSA樣品中總蛋白的含量(mg/ml);凝膠鱟試劑定性檢測AOPPs和未修飾BSA中內(nèi)毒素的含量。
　　2.2 MTT法檢測AOPPs和芍藥苷對HUVECs活性的影響
　　采用MTT還原法先測定不同濃

5、度的AOPPs和200μg/ml BSA以及不同濃度芍藥苷對細胞活性的影響。然后測定不同濃度芍藥苷預(yù)處理對AOPPs刺激的HUVECs活性的影響。
　　2.3 DCFH-DA熒光探針檢測AOPPs對HUVECs內(nèi)ROS水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　DCFH-DA熒光探針先檢測不同濃度的AOPPs孵育90 min以及200μg/mlAOPPs孵育不同時間對HUVECs內(nèi)ROS的生成量的影響。然后測定不同濃度的芍藥苷以及不

6、同阻斷劑:RAGE受體阻斷劑FPS-ZM1(230 nM)，NADPH氧化酶抑制劑Apocynin(100μM)，氧自由基清除劑NAC(5 mM)對AOPPs誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS的阻斷作用。
　　2.4 Fluo-3 AM熒光染料檢測AOPPs對HUVECs內(nèi)Ca2+水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　Fluo-3 AM熒光染料檢測不同濃度的AOPPs與BSA刺激HUVECs內(nèi)Ca2+的波動情況。同時檢測芍藥苷(200

7、μM)以及不同阻斷劑:FPS-ZM1、Apocynin、和NAC對AOPPs刺激HUVECs內(nèi)Ca2+超載的抑制情況。
　　2.5 流式細胞儀檢測AOPPs對HUVECs線粒體膜電位水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　我們通過MitoTracker(R)Deep Red and MitoTracker(R) Green雙染標記HUVECs，使用流式細胞儀檢測不同濃度的AOPPs和BSA對HUVECs線粒體膜電位的影響。同時檢

8、測芍藥苷(200μM)以及不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC對AOPPs造成的細胞內(nèi)線粒體膜電位功能障礙的恢復(fù)情況。
　　此外我們還使用激光共聚焦成像系統(tǒng)觀察記錄AOPPs和BSA與HUVECs孵育不同時間線粒體膜電位的變化情況。
　　2.6 ATP試劑盒檢測AOPPs對HUVECs內(nèi)ATP水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書檢測不同濃度的AOPPs和BSA對HUVECs內(nèi)A

9、TP水平的影響情況，同時檢測芍藥苷(200μM)以及不同阻斷劑:Apocynin，F(xiàn)PS-ZM1和NAC對AOPPs耗竭HUVECs內(nèi)ATP的恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　3.1 AOPPs的鑒定
　　結(jié)果顯示AOPPs含量為142.4±9.8μmol/g，遠遠高于未修飾的BSA的0.2±0.02μmol/g。且所有AOPPs制備品經(jīng)凝膠法鱟試劑測定內(nèi)毒素含量均低于0.25EU/ml。
　　3.2 AOPPs以及芍

10、藥苷對HUVECs活性的影響
　　檢測結(jié)果顯示，≥200μg/ml AOPPs與NC組相比較，對細胞活性有顯著影響(p＜0.01);50-400μM芍藥苷與NC組相比較，對細胞活性無顯著影響。芍藥苷預(yù)處理1h，然后加入AOPPs孵育24 h，結(jié)果顯示50-400μM芍藥苷與AOPPs組相比較，均能夠提高細胞存活率(p＞0.05)。
　　3.3 AOPPs對HUVECs內(nèi)ROS的影響以及芍藥苷的抑制作用
　　未經(jīng)修飾的B

11、SA不能誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS，而AOPPs能夠刺激HUVECs產(chǎn)生大量的ROS，與NC組相比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);于200μg/ml濃度在90min時達到峰值。而芍藥苷以及不同阻斷劑:Apoeynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理HUVECs均能部分抑制ROS的產(chǎn)生，與AOPPs組相比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　3.4 AOPPs對HUVECs內(nèi)Ca2+的影響以及芍藥苷的抑制作用
　　未經(jīng)修飾的BS

12、A對HUVECs內(nèi)Ca2+波動無影響，而AOPPs呈濃度依賴性的方式升高HUVECs內(nèi)的Ca2+濃度，與NC組相比較均有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。芍藥苷以及不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理細胞均能部分抑制AOPPs導(dǎo)致的Ca2+超載，且與AOPPs組相比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　3.5 AOPPs對HUVECs線粒體膜電位的影響以及芍藥苷的保護作用
　　結(jié)果顯示，AOPPs呈濃度依賴性

13、的方式降低HUVECs線粒體膜電位，與NC組相比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);此外芍藥苷與不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理HUVECs均可以部分阻斷AOPPs對HUVECs造成的線粒體功能障礙，與AOPPs組相比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　3.6 AOPPs對HUVECs內(nèi)ATP的影響以及芍藥苷的抑制作用
　　HUVECs內(nèi)ATP的濃度隨AOPPs濃度的升高而降低，與NC組相比較有統(tǒng)計學

14、意義(p＜0.05)，而未被修飾的BSA對HUVECs內(nèi)的ATP水平無影響。芍藥苷以及不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理HUVECs1 h，均能部分恢復(fù)AOPPs降低HUVECs內(nèi)的ATP水平，與AOPPs組相比較均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　芍藥苷能夠有效地保護血管內(nèi)皮細胞因AOPPs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。其保護的機制可能是阻斷AOPPs與RAGE受體的結(jié)合從而抑制Nox2/Nox