人結(jié)締組織生長因子ABC-EIA檢測方法的建立及初步臨床應用.pdf

1、研究目的：器官和組織纖維化是眾多疾病發(fā)展的終末階段，它能導致心、肝、腎等重要臟器的結(jié)構(gòu)改變，功能喪失。研究表明，結(jié)締組織生長因子(CTGF)在心肌梗死、糖尿病、糖尿病腎病、腫瘤等多種疾病狀態(tài)中皆有不同程度的表達上調(diào)。目前CTGF的檢測主要依靠RT-PCR、WesternBlot、IH等方法，尚無商品化ELISA檢測試劑盒的報道，為能簡便、快速的檢測疾病狀態(tài)下CTGF的表達情況，探討其與器官組織纖維化之間的關(guān)聯(lián)，建立檢測人血清中CTGF的

2、ABC-EIA法，該方法簡便、高效、靈敏度高，可以大批量檢測各種體液標本，ABC-EIA的建立可能為臨床纖維化疾病的早期診斷提供一個新的檢測指標；同時利用所建方法檢測高血壓病人以及正常人血清中CTGF水平，探討其在人體內(nèi)異常表達的意義，為臨床應用打下基礎(chǔ)。 研究方法： 1．利用DNA重組技術(shù)，從血管內(nèi)皮細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設計特異引物，擴增CTGF C區(qū)基因，插入質(zhì)粒表達載體，陽性質(zhì)粒導入大腸桿菌BL

3、21(DE3)，加入IPTG誘導表達，經(jīng)溶菌酶處理、超聲破碎后，用Histrap Kit和SephedexG-200純化，獲得CTGF標準品及抗原；以重組CTGF為免疫原，采用皮下多點注射法制備CTGF多克隆抗體；雜交瘤技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌CTGF單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將其中效價和相對親和力較高的7C7細胞株復蘇培養(yǎng)后注射于BAL,B/c小鼠腹腔，誘導產(chǎn)生腹水；采用離子交換層析法純化單抗和多抗；間接ELISA檢測純化后單抗和多抗的效價和

4、相對親和力，并用SDS-PAGE鑒定所得CTGF標準品、單抗、多抗的純度；Western Blot鑒定單抗的特異性。 2．比較生物素-親和素用于顯色系統(tǒng)和捕獲系統(tǒng)，優(yōu)化實驗條件，建立ABC-EIA法，并對其在靈敏度、批內(nèi)差異、批間差異、回收試驗、干擾試驗(血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油)等方面作評價。利用所建立的ABC-EIA方法檢測標本中CTGF的水平。 結(jié)果： 1．CTGF標準品純化后用SDS-PAGE鑒定純度，

5、顯示在30KD處出現(xiàn)單一蛋白條帶，與預期分子量一致。采用SDS-PAGE鑒定單抗和多抗的純度，結(jié)果顯示在25KD和50KD處各有一條帶，分別為免疫球蛋白的輕鏈和重鏈。用Western Blot鑒定單抗的特異性，結(jié)果顯示在30KD處有一條帶，即重組CTGF的位置。間接ELISA結(jié)果顯示：單抗、多抗的效價分別為2.0×10<'3>、4.0×10<'3>，相對親和力分別為6.0×10<'7>、7.5×10<'8>； 2.生物素-親和素

6、用于顯色系統(tǒng)優(yōu)于用于捕獲系統(tǒng)，ABC-EIA方法的靈敏度為1.0 ng/mL，批內(nèi)、批間差異分別為5.4％、7.5％，平均回收率104.2％，血紅蛋白濃度在0～50 mmol/L、總膽紅素在0～150umol/L、三酰甘油在0～2.0 mmol/L對測定結(jié)果無影響。 3.120例高血壓病人總體血清CTGF平均水平明顯高于正常健康對照組，差異顯著(p<0.05)；高血壓合并急性心肌梗死組，高血壓合并心絞痛組和單純高血壓組CTGF平

7、均水平明顯均高于正常健康對照組，比較差異顯著(p<0.05，p<0.05，p<0.05)；其中，高血壓合并急性心肌梗死組CTGF平均水平明顯高于高血壓合并心絞痛組和單純高血壓組，且比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05，p<0.05)；高血壓合并心絞痛組和單純高血壓組比較差異不顯著(p>0.05)。 結(jié)論： 1.制備的CTGF標準品、單克隆抗體和多克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度在95％以上，Westem Blot結(jié)果顯示單抗